李丹丹，傅佩寧，楊宏志，朱磊，梁英

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319）

（2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100000）

花色苷是葡萄果皮呈現(xiàn)多種顏色的主要原因，而糖基轉(zhuǎn)移酶是生成花色苷的關(guān)鍵酶[1]。研究表明糖基轉(zhuǎn)移酶幾乎存在于所有的生物體中，直接參與低聚糖、單糖苷和聚糖苷等生物合成，目前已形成超基因家族[2]。葡萄中最常見的兩種糖基轉(zhuǎn)移酶是 UDP-葡萄糖:類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-Glucose:flavonoid-3-O-Glucosyltransferase，3GT）和 UDP-葡萄糖:類黃酮5-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-Glucose:flavonoid-5-O-Glucosyltransferase，5GT），二者屬于 GT1家族中不同的亞家族[3]?；ㄉ卦?GT的作用下生成 3-O-單葡糖苷，而3-O-單葡糖苷在5GT作用下進一步反應生成3,5-O-雙葡糖苷。

葡萄中3GT的研究報道較多，而5GT報道相對較少。植物中5GT的研究最早是從花卉中開始的，花卉植物中的 5-O-糖基化作用是使花色多樣化的重要原因。目前已在很多植物中發(fā)現(xiàn)了能催化3-O-單葡糖苷生成3,5-O-雙葡糖苷的5GT，最早發(fā)現(xiàn)于朝顏剪秋羅(Silene dioica)[4]、矮牽牛(Petunia hybrid)[5]、紫羅蘭(Matthiola incana)[6]和紫蘇(Perilla frutescens)[7]中，后續(xù)又在大麗花(Dahlia variabilis)[8]、花菖蒲(Iris ensata)[9]、荷蘭鳶尾(Iris hollandica)[10]、三花龍膽(Gentiana triflora)[11]、康乃馨(Dianthus caryophyllus)[12]和芍藥(Paeonia lactiflora)[13]等多種鮮花中發(fā)現(xiàn)。在野生馬鈴薯(Solanum Sogarandinum)[14]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[15]和茄子(Solanum melongena)[16]等植物中也發(fā)現(xiàn)了5GT。對于葡萄中雙糖苷花色苷的研究，Jánváry 等[17]在歐美雜交葡萄品種‘Regent’中克隆出 2個功能不同的5GT等位基因，分別為來自‘Chambourcin’能催化 3-O-單葡糖苷生成 3,5-O-雙葡糖苷的Cha5GT，和‘Diana’不能催化合成 3,5-O-雙葡糖苷的Dia5GT，并證實Dia5GT不能合成雙糖苷花色苷是由氨基酸突變和提前終止密碼子導致 C-末端的截斷造成的，說明歐亞種葡萄不能合成雙糖苷花色苷的原因是5GT等位基因由于突變而喪失5GT酶活性。但近期有報道稱在歐亞種葡萄中檢測到痕量級雙糖苷花色苷[18～20]。Yang等[19]在歐亞種葡萄中發(fā)現(xiàn)多個喪失功能的5GT等位基因。He等[21]在山葡萄‘左山一’中克隆出一個5GT基因，并通過異源表達證實其能夠催化合成3,5-O-雙葡糖苷。

山葡萄(Vitis amurensisRupr)在我國主要分布在東北三省，具有極強的抗寒能力。山葡萄果實成熟后呈紫黑色，具有粒小皮厚、汁少籽多、酸高糖低、單寧多、色素濃等特點，不宜鮮食，主要用于釀酒[22～24]。山葡萄酒是中國獨有的特殊葡萄酒種，顏色呈寶石紅，因其色澤濃郁、果香獨特和口感醇厚等特點而廣受消費者喜愛[25]。但山葡萄中存在大量雙糖苷花色苷，嚴重影響葡萄酒的陳釀品質(zhì)。目前，關(guān)于山葡萄雙糖苷花色苷合成機制的研究較少，本研究選取了4種釀酒葡萄品種，分別是歐洲種‘赤霞珠’、山葡萄‘左山一’、山歐雜交品種‘哈?！汀蠹t一’為實驗材料，通過PCR等技術(shù)克隆5GT等位基因，分析山葡萄及山歐雜交品種中5GT等位基因的差異，為解析山葡萄及其雜交品種間糖基化花色苷組成差異的機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

‘赤霞珠’（V. viniferaL.cvCabernet Sauvignon）、‘左山 一 ’(V. amurensisRupr)、 ‘哈 桑 ’(V. vinifera,V.amurensis)、‘左紅一’(V. vinifera,V. amurensis)的葉片采集于中國農(nóng)業(yè)大學北京上莊實驗站葡萄種質(zhì)資源圃，取葡萄枝頂端第五片完全展開的無病害幼葉，用鑷子裝進5 mL離心管中，置于液氮罐中速凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 基因組DNA提取

取適量葡萄葉片于液氮中研磨成粉，用優(yōu)化改良的CTAB法提取高質(zhì)量葡萄基因組DNA（gDNA）[26]，用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano-drop濃度儀檢測DNA質(zhì)量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增

引用Jánváry等[17]克隆歐亞種葡萄中5GT的引物，F(xiàn)orward Primer：5’-CACTTTCCACCTGAGACACC-3’和 Reverse Primer：5’-CAGTACATCAAACGCCACTC-3’，以葡萄gDNA為模板，通過PCR擴增得到目的片段，PCR產(chǎn)物預期大小為1455 bp。PCR反應體系為50 μL，包括 35 μL ddH2O，4 μL dNTP，5 μL 10×pfu reaction buffer，正反引物各 2 μL，1.5 μL gDNA，0.5 μL pfu聚合酶。反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸240 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 TA克隆與鑒定

通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小是否與預期一致，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目的片段。將純化的目的基因連接到pLB載體上，再用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH-5α中，轉(zhuǎn)化成功后挑取單菌落，進行菌落PCR，通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并隨機選取陽性克隆送至博邁德生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 序列分析

序列拼接利用SeqMan軟件完成；序列校準、開放閱讀框查找及氨基酸序列翻譯利用 Editseq軟件完成；多序列比對利用DNAMAN8.0軟件完成；同源性序列檢索利用 NCBI數(shù)據(jù)庫中 BLAST程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）完成。

1.6 生物信息學分析

系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建利用MEGA5.1軟件完成，采用Neighbor-joining法；蛋白跨膜區(qū)分析和預測利用在線軟件 THXHMM2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）完成；氨基酸序列分析利用蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫 Pfam24.0(http://pfam.sanger.ac.uk/search/sequence)完成；信號肽分析和預測利用在線軟件 SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)完成；亞細胞定位預測和分析利用在線軟件TargetP1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) 完成；預測5GT蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)利用在線軟件GOR(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?pa ge=npsa_gor4.html)，預測理化性質(zhì)等信息有在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）完成；預測蛋白質(zhì)三維立體結(jié)構(gòu)利用在線網(wǎng)站 Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 gDNA質(zhì)量檢測

通過改良的CTAB法提取葡萄幼葉中g(shù)DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，條帶清晰完整，沒有拖尾和彌散現(xiàn)象，無蛋白污染或降解。

通過 Nano-drop濃度儀測定 DNA濃度，均在1000～1300 ng/μL 范圍內(nèi)，OD260/280值在1.8～2.0 范圍，OD230/280值在2.0～2.2范圍，DNA質(zhì)量較好，無雜質(zhì)污染，可以用于后續(xù)實驗。

2.2 5GT等位基因的克隆

葡萄中5GT基因沒有內(nèi)含子[19]，將NCBI上發(fā)表的‘左山一’Va5GT(KF996717.1)核苷酸序列放入葡萄基因組網(wǎng)站（http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）中 BLAST，找到黑比諾中一個位于9號染色體上的5GT基因，全長1395 bp，兩條核苷酸序列比對同源性＞99%，我們確定位于9號染色體上的5GT基因組序列沒有內(nèi)含子。將測序結(jié)果拼接后與Jánváry 等[17]在歐美雜種葡萄‘Regent’中發(fā)現(xiàn)的Cha5GT和 NCBI上已發(fā)表的山葡萄Va5GT(KF996717.1)比對后發(fā)現(xiàn)同源性＞99%，說明 7個目的基因均為5GT等位基因。

2.3 序列分析

用軟件找到7個5GT等位基因的開放閱讀框，將其翻譯成氨基酸序列，再與Cha5GT、Dia5GT（由慕尼黑大學的施瓦布教授提供）、NCBI上已發(fā)表的山葡萄Va5GT(KF996717.1)、圓葉葡萄5GT(KT327064.1)和已經(jīng)完成全基因組測序的歐亞種葡萄‘黑比諾’一起進行序列比對，結(jié)果如圖 1。通過葡萄基因組網(wǎng)站BLAST確定以上5GT基因均位于9號染色體上。

圖1 5GT等位基因多序列比對圖Fig.1 Multiple sequence alignment of 5GT alleles

從‘赤霞珠’中克隆出兩個5GT等位基因，命名為VvCS5GT1和VvCS5GT2。VvCS5GT1核苷酸序列全長1394 bp，在歐亞種葡萄中普遍存在，由于第902位堿基缺失，導致其氨基酸序列從第301個氨基酸開始移碼突變（G301#），并在第328位產(chǎn)生提前終止密碼子（E328*），造成C-末端的截斷，喪失UGT家族均有的一個由44個氨基酸組成的保守序列（PSPG-box）[27～29]。而VvCS5GT2比VvCS5GT1在歐亞種葡萄中相對少見，只有8%的比例存在[19]。與VvCS5GT1相比，VvCS5GT2缺失第1182和1183位‘AG’兩個堿基，因此全長僅1392 bp。用Editseq軟件尋找開放閱讀框發(fā)現(xiàn)兩個基因的開放閱讀框完全相同，都是924 bp，編碼307個氨基酸，預測分子量為33.57 ku，等電點為4.768。與有正常5GT酶功能的Cha-5GT和Va5GT相比，VvCS5GT1和VvCS5GT2的序列特征是由于堿基缺失產(chǎn)生提前終止密碼子和移碼突變導致肽鏈縮短，因此推測VvCS5GT1和VvCS5GT2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均喪失5GT酶的正常功能，不能生成雙糖苷花色苷，這與Yang等[19]人和 Xing等[20]人的結(jié)論相符?！嘞贾椤械膬蓚€5GT等位基因VvCS5GT1和VvCS5GT2與其他葡萄品種5GT基因序列比對發(fā)現(xiàn)還存在兩個氨基酸突變P78L（第78個氨基酸由P變成L）和D248Y，這也許是‘赤霞珠’5GT的品種特征性突變。

‘左山一’中得到 2個5GT等位基因，命名為VaZSY5GT1和VaZSY5GT2，二者之間有3處堿基突變，產(chǎn)生3處氨基酸差異，分別為E76D、V208A，及第703位堿基缺失導致VaZSY5GT2從第234個氨基酸開始移碼突變（V236#）并產(chǎn)生提前終止密碼子(R302*)。VaZSY5GT1全長為1395 bp，開放閱讀框為1395 bp，編碼464個氨基酸，預測分子量為51.48 ku，等電點為5.069。VaZSY5GT2全長894 bp，編碼297個氨基酸，預測分子量33.02 ku，等電點6.424。VaZSY5GT1與NCBI上發(fā)表的山葡萄‘左山一’Va5GT同源性高達99.93%，核苷酸序列只有一個堿基差異，即氨基酸差異R412K，與Cha5GT序列同源性高達99.71%，只有4個堿基差異，氨基酸變化為D76E、A208V、A259S、L372M，推測VaZSY5GT1有5GT酶功能，而VaZSY5GT2因移碼突變和C-末端截斷喪失此酶功能。

‘哈桑’中得到 2個5GT等位基因，命名為Vv×VaHS5GT1和Vv×VaHS5GT2，兩者之間共有 16處堿基差異，是四種葡萄中內(nèi)部差異最大的品種。其中5處是無義突變，所以存在11處氨基酸差異。非保守區(qū)氨基酸突變有I93M、S103G、K187N、Y262C、S283P、ENEE316-319·、T383P、E389K、A395G、R422G，保守區(qū)氨基酸突變僅有 E343D。Vv×VaHS5GT1核苷酸序列全長為1395 bp，開放閱讀框也為1395 bp，編碼464個氨基酸，預測分子量為51.66 ku，等電點為4.976；Vv×VaHS5GT2全長為1383bp，開放閱讀框為1383 bp，編碼460個氨基酸，預測分子量為50.95 ku，等電點為5.093。將Vv×VaHS5GT1與其他5GT比對發(fā)現(xiàn)幾處錯義突變M93I、G113W、N187K、I282M、K318E、K389E、G422R，沒有堿基缺失、移碼突變和提前終止密碼子；而將Vv×VaHS5GT2與其他5GT比對發(fā)現(xiàn)不僅有錯義突變S103G、G113W、Y262C、I282M、S283P、E343D、T383P，還有因缺失 12個堿基導致的框內(nèi)缺失突變ENKE316-319·，其中S103G、S283P、ENKE316-319·、T383P四處氨基酸突變在甜冬葡萄（V. cinerea）中也存在，而且甜冬葡萄中雙糖苷花色苷含量＜15%[18,28～30]，‘哈?！须p糖苷花色苷占總花色苷含量的10%[31]。Vv×VaHS5GT1被推測可以正常發(fā)揮5GT酶功能，Vv×VaHS5GT2由于氨基酸缺失、錯義突變則可能喪失5GT酶正常功能。G113W、I282M突變在Vv×VaHS5GT1和Vv×VaHS5GT2中均有出現(xiàn)，且只存在于‘哈?！?，可推測‘哈?！?GT品種特征性突變。

‘左紅一’中克隆出兩個5GT等位基因，其中一個命名為Vv×VaZHY5GT，另一個5GT基因經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)和‘左山一’中VaZSY5GT2核苷酸序列完全相同，即‘左紅一’與‘左山一’擁有一個共同的5GT基因VaZSY5GT2。Vv×VaZHY5GT全長1395 bp，開放閱讀框為1395 bp，編碼464個氨基酸，預測分子量為51.43 ku，等電點為 5.069；Vv×VaZHY5GT與VaZSY5GT1只有一個堿基差異T1195A，氨基酸變化為L399M。將Vv×VaZHY5GT與有功能的Va5GT和Cha5GT序列比對發(fā)現(xiàn)同源性＞99%，且沒有提前終止密碼子或移碼突變，只有幾個位于非保守區(qū)的錯義突變，而‘左紅一’中雙糖苷花色苷占總花色苷含量的31%[31]，因此推測Vv×VaZHY5GT可以催化合成雙糖苷花色苷。

將所得5GT基因序列在葡萄基因組網(wǎng)站（http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）中BLAST，找到‘黑比諾’5GT基因，全長1395 bp，與Va5GT和Cha5GT的堿基序列同源性＞99%，開放閱讀框為1203 bp，編碼400個氨基酸，從第396個氨基酸開始移碼突變并存在提前終止密碼子，因此推測‘黑比諾’5GT基因沒有功能。NCBI上發(fā)表的圓葉葡萄5GT基因部分核苷酸序列長1394 bp，部分蛋白質(zhì)序列由464個氨基酸組成。與其他5GT基因序列比對后，發(fā)現(xiàn)圓葉葡萄5GT沒有終止密碼子，但序列同源性較高，只有三個圓葉葡萄品種特征性等位變異N20K、S286T和Q462L。除此之外，圓葉葡萄5GT與Cha5GT有2處等位變異D76E和A208V，但是這兩個氨基酸位置保守性非常低，Vv×VaZHY5GT、VaZSY5GT1、Va5GT和圓葉葡萄5GT的第76個和第208個氨基酸為谷氨酸（E）和纈氨酸（V），而在VvCS5GT1、VvCS5GT2、VaZSY5GT2、Vv×VaHS5GT1、Vv×VaHS5GT2、‘黑比諾’5GT、Cha5GT和Dia5GT中為天冬氨酸（D）和丙氨酸（A），可見這兩個氨基酸位置不影響5GT酶的功能。此外，圓葉葡萄中只存在雙糖苷花色苷[31]，因此推測圓葉葡萄5GT有功能。

2.4 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

圖2 系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree

將所得5GT序列VvCS5GT1、VvCS5GT2、VaZSY5GT1、VaZSY5GT2、Vv×VaHS5GT1、Vv×VaHS5GT2、Vv×VaZHY5GT置于 NCBI數(shù)據(jù)庫中BLASTP，找到其他葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)序列，用MEGA5.1軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖2。

在NCBI中搜索與花色苷生物合成有關(guān)的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，將其與本研究克隆的7個5GT序列比對并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。如圖2所示，進化樹根據(jù)區(qū)域選擇性分成三簇，根據(jù)每簇的基因組成判斷三個簇為UGT家族中的三個亞家族，分別為3GT亞家族，7GT亞家族和5GT亞家族。從‘赤霞珠’、‘哈?！ⅰ蠹t一’和‘左山一’中克隆出的7個5GT基因全部位于5GT亞家族，而且被推測在葡萄中不能合成雙糖苷花色苷的無功能5GT基因除Vv×VaHS5GT2外全部聚集在橫線下方，特點是均存在移碼突變和提前終止密碼子，而有功能的5GT基因則聚集在橫線上方，聚集緊密說明遺傳距離較近。

Vv×VaHS5GT2雖然被推測為無功能5GT基因，但其與Vv×VaHS5GT1序列同源性最高，且沒有移碼突變或提前終止密碼子，故與劃分在橫線上方的Vv×VaHS5GT1遺傳距離較近。

2.5 亞細胞定位預測

通過 THXHMM2.0在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）對7個5GT等位基因進行蛋白跨膜區(qū)分析和預測，結(jié)果表明均不存在跨膜區(qū)，不屬于膜結(jié)合蛋白。用 Pfam24.0在線網(wǎng)站(http://pfam.sanger.ac.uk/search/sequence)分析蛋白質(zhì)，結(jié)果表明7個5GT均屬于GT1家族，GT-B型折疊。用 SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測和分析以上7個5GT蛋白信號肽，結(jié)果表明均不屬于膜結(jié)合蛋白，無信號肽，非分泌蛋白。通過TargetP1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) 對5GT蛋白進行亞細胞定位預測和分析，結(jié)果如表1，說明5GT均存在于細胞中除線粒體、葉綠體外的其他部位，且再次驗證不存在信號肽。

表1 亞細胞定位分析表Table 1 Subcellular localization analysis

2.6 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測

通過 GOR 網(wǎng)站(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預測 5GT蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：VvCS5GT1中α-螺旋占37.46%，延伸鏈占14.98%，無規(guī)則卷曲占47.56%；VvCS5GT2中α-螺旋占37.46%，延伸鏈占14.98%，無規(guī)則卷曲占 47.56%；VaZSY5GT1中α-螺旋占33.62%，延伸鏈占20.47%，無規(guī)則卷曲占45.91%；VaZSY5GT2中α-螺旋占36.53%，延伸鏈占21.60%，無規(guī)則卷曲占 41.87%；Vv×VaHS5GT1中α-螺旋占38.15%，延伸鏈占17.89%，無規(guī)則卷曲占43.97%；Vv×VaHS5GT2中α-螺旋占33.70%，延伸鏈占19.78%，無規(guī)則卷曲占 46.52%；Vv×VaZHY5GT中α-螺旋占34.70%，延伸鏈占19.83%，無規(guī)則卷曲占45.47%。

圖3 三級結(jié)構(gòu)預測圖Fig.3 Tertiary structure prediction

用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）預測5GT蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，結(jié)果如表2。肽鏈相對完整的Vv×VaHS5GT1、Vv×VaHS5GT2、Vv×VaZHY5GT和VaZSY5GT1消光系數(shù)較大，而由于提前終止密碼子而截斷的VvCS5GT1、VvCS5GT2、VaZSY5GT2消光系數(shù)相對較小，說明肽鏈縮短對消光系數(shù)有一定影響。7個5GT等位基因的體外半衰期均達到30 h，不穩(wěn)定系數(shù)均＞40，因此均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。親水性數(shù)值越低蛋白質(zhì)親水性越強，數(shù)值越高疏水性越強，VaZSY5GT2為疏水性蛋白，其余5GT均有一定親水性。用 Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/）預測5GT蛋白質(zhì)三維立體結(jié)構(gòu)，如圖 3所示，VvCS5GT1和VvCS5GT2擁有相同三級結(jié)構(gòu)，前面被推測為有5GT酶功能的Vv×VaHS5GT1、Vv×VaZHY5GT和VaZSY5GT1蛋白結(jié)構(gòu)折疊緊密且相對完整，而被推測為無5GT酶功能的VvCS5GT1、VvCS5GT2、VaZSY5GT2結(jié)構(gòu)均松散且不完整。雖然Vv×VaHS5GT2蛋白結(jié)構(gòu)相對完整，但與Vv×VaHS5GT1相比可以看出部分蛋白結(jié)構(gòu)缺失。

表2 5GT蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預測Table 2 Prediction of physicochemical properties of 5GT protein

3 討論

葡萄中糖基化花色苷包括單糖苷花色苷和雙糖苷花色苷，在不同葡萄品種中糖基化花色苷的組成差異明顯，如山葡萄‘左山一’、山歐雜種葡萄‘左紅一’和‘哈?！须p糖苷花色苷分別占總花色苷含量的82%、31%和10%[31]，而決定葡萄糖基化花色苷組成的重要原因是雙糖苷花色苷的關(guān)鍵酶基因5GT的基因型。因此，本研究選擇‘左山一’、‘左紅一’和‘哈桑’這3個山葡萄/山歐雜交品種和 1個歐亞種葡萄‘赤霞珠’作為實驗材料，通過基因克隆等技術(shù)得到5GT等位基因的核苷酸序列，探究5GT等位基因的核苷酸突變情況和氨基酸組成差異，并利用生物信息學軟件對5GT等位基因進行結(jié)構(gòu)分析和功能預測。在實驗過程中，四種葡萄樣品共送樣測序近100個單克隆，此外還有PCR產(chǎn)物直接測序以及分段測序多個樣品，而且實驗期間換過高保真聚合酶、DNA模板、引物和測序公司等實驗條件以保證實驗結(jié)果的準確性。

Yang等[19]人在8個葡萄種中共發(fā)現(xiàn)54個5GT等位基因，并按照突變特點分類。其中36個不存在移碼突變或提前終止密碼子的5GT屬于W型，可能有5GT酶功能，剩余18個5GT基因由于移碼突變或提前終止密碼子可能喪失5GT酶活性，根據(jù)移碼突變或終止密碼子的位置分成A～G七種類型。Yang等[19]人發(fā)現(xiàn)的54個5GT等位基因中有6個與本研究結(jié)果一致，VvCS5GT1與Yang等[19]人發(fā)現(xiàn)的5GT基因型A1一致，VvCS5GT2與A2一致，A1和A2只存在于歐亞種野生型（V. viniferassp.sylvestris）葡萄和歐亞種栽培品種（V.viniferassp.vinifera）中，A型5GT基因的突變特征是從第301個氨基酸開始移碼突變（G301#）。VaZSY5GT2與B1一致，B1不僅存在于歐亞種葡萄（V.vinifera）中，還在一些雜交品種中出現(xiàn)，B型突變特征是從第 234個氨基酸開始移碼突變（V236#）。VaZSY5GT1與 W5一致，W5來自山葡萄（V.amurensis），Vv×VaHS5GT2與W23一致，W23來自甜冬葡萄（V. cinerea），Vv×VaHS5GT1與W19一致，而 W19在甜冬葡萄（V. cinerea）、美洲葡萄（V.labrusca）、夏葡萄（V. aestivalis）以及一些雜交葡萄品種中均有出現(xiàn)。只有Vv×VaZHY5GT不存在于Yang等[19]發(fā)現(xiàn)的54個5GT等位基因中，但與W5相似性最高，只有一個堿基差異 A1195T，相應的氨基酸變化為M399L，可能是一個未被發(fā)現(xiàn)的新5GT基因型。He等[21]在‘左山一’中克隆出一個Va5GT，通過研究其表達及生化特征證實其有5GT酶活性，可以合成雙糖苷花色苷。而本研究從‘左山一’中克隆的VaZSY5GT1與Va5GT比對后發(fā)現(xiàn)有一個堿基差異G1235A，即氨基酸差異R412K了，但在Yang等人[19]報道的54個5GT等位基因中并未找到與Va5GT完全相同的基因型，Va5GT可能也是一個新的5GT等位基因。

雖然基因突變的隨機性很大，但也能發(fā)現(xiàn)一些突變規(guī)律，如Vv×VaHS5GT2和甜冬葡萄都在堿基位置947-958缺失12個堿基，造成連續(xù)四個氨基酸框內(nèi)缺失（ENKE316-319·），Vv×VaHS5GT1和夏葡萄（V.aestivalis）在該區(qū)域存在共同的氨基酸突變 K318E，說明該區(qū)域是突變熱點區(qū)，氨基酸的組成和數(shù)量都是可變的[19]。另一個突變規(guī)律是第 76位氨基酸存在三種突變形式，D76E出現(xiàn)在山葡萄和圓葉葡萄中，D76N出現(xiàn)在歐亞種葡萄中，D76Y也出現(xiàn)在圓葉葡萄中[19]。

以被證實有功能的5GT-Cha為參照序列，根據(jù)突變特征，將5GT等位基因分成三種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型5GT等位基因的突變特征是存在提前終止密碼子和移碼突變，包括VvCS5GT1、VvCS5GT2、VaZSY5GT2、Dia5GT和 ‘黑 比 諾 ’5GT； 而Vv×VaHS5GT2屬于Ⅱ型突變，特征是框內(nèi)缺失突變，無移碼突變或提前終止密碼子；Ⅲ型突變特征是僅發(fā)生氨基酸置換，包括Vv×VaHS5GT2、Vv×VaZHY5GT、VaZSY5GT1、Va5GT和圓葉葡萄5GT。顯然，Ⅰ型和Ⅱ型突變都可能使5GT酶失去活性，而Ⅲ型突變則不會影響5GT酶活性。這與前面序列分析的結(jié)果相符，與Yang等人[19]的結(jié)果也一致。

VvCS5GT1、VvCS5GT2、VaZSY5GT2中發(fā)生肽鏈截斷，因此推測其編碼的蛋白質(zhì)不能正常發(fā)揮5GT酶功能，從而使葡萄中的雙糖苷花色苷含量降低。‘赤霞珠’中 2個5GT基因均沒有功能，這也許是‘赤霞珠’中幾乎不含有雙糖苷花色苷的原因，因此純歐亞種葡萄釀造的葡萄酒陳年潛力更好。‘哈?！?、‘左紅一’和‘左山一’中均含有一個功能性5GT等位基因，但雙糖苷花色苷占比卻有明顯差異，有一種可能性是其他染色體上也存在5GT等位基因，說明位于9號染色體上的5GT等位基因還不足以解釋山葡萄及其雜交品種中花色苷的組成差異。還有一種可能是基因序列差異導致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的酶功能和活性不同，使雙糖苷花色苷合成量不同。Xing等[20]人在歐亞種葡萄（V. vinifera）‘赤霞珠’中發(fā)現(xiàn)5個5GT候選基因Vv5GT1、Vv5GT2、Vv5GT3、Vv5GT4、Vv5GT5，其中Vv5GT1就是本研究中的VvCS5GT1和Yang等人[19]報道的A1，其余四個基因經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)Vv5GT2位于 17號染色體，而Vv5GT3、Vv5GT4和Vv5GT5則位于5號染色體。Hall等人[33]在美洲種葡萄(V. labrusca)中發(fā)現(xiàn)的四個類似5GT基因OGT1、OGT2、OGT3、OGT4經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)位于5號染色體上。因此，繼續(xù)在其他染色體上尋找更多的5GT等位基因并且驗證基因功能，是我們下一步研究的重要內(nèi)容，為探究不同山葡萄品種間糖基化花色苷組成差異的機制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從‘赤霞珠’、‘左山一’、‘哈?！?、‘左紅一’4 個葡萄品種中共克隆出7個等位基因，均位于9號染色體上。‘左紅一’和‘左山一’中有一個相同的5GT等位基因。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)VvCS5GT1、VvCS5GT2、Vv×VaHS5GT2、VaZSY5GT2中存在氨基酸缺失、移碼突變或提前終止密碼子，因此推測這4個5GT等位基因失去5GT酶活性，不能合成雙糖苷花色苷；而Vv×VaHS5GT1、Vv×VaZHY5GT、VaZSY5GT1僅有基礎(chǔ)氨基酸置換，與有功能的Cha5GT一致性＞99%，因此推測這三個序列可以合成雙糖苷花色苷。