董文超，王斌，潘力

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

白曲作為一種重要的麩曲，酸性蛋白酶對(duì)糧食原料顆粒的溶解作用，促進(jìn)了糖化作用，提高了淀粉的利用率，在一定程度上提高了出酒率，在酸性條件下，將植物蛋白分解為各類氨基酸，為堆積過(guò)程中的美拉德反應(yīng)提供前提物質(zhì)[1]。并且白曲酸性蛋白酶影響著芝麻香酒中雜環(huán)化合物的數(shù)量和種類，對(duì)芝麻香酒的風(fēng)味有極其重要的影響。提高白曲酸性蛋白酶含量，對(duì)提高芝麻香酒的生產(chǎn)效率及穩(wěn)定和提高質(zhì)量都有重要的意義[2]。因此構(gòu)造一株能高效表達(dá)酸性蛋白酶，而不引入其他無(wú)關(guān)蛋白的菌株對(duì)白酒生產(chǎn)工藝的改進(jìn)具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的酸性蛋白酶基因來(lái)源主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和米曲霉。費(fèi)笛波[3]等對(duì)黑曲霉變異菌株6042進(jìn)行液體深層發(fā)酵，經(jīng)4批次2300 L發(fā)酵罐擴(kuò)大，使得酸性蛋白酶酶活達(dá)到了2535 U/mg，方春玉等[4]采用固體發(fā)酵技術(shù)，以黑曲霉為菌種，全面優(yōu)化發(fā)酵條件，使發(fā)酵產(chǎn)物酸性蛋白酶酶活達(dá) 24350 U/g，平均酶活提高64.6%，楊琥等[5]以畢赤酵母為宿主，表達(dá)宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因（GenBankTM accession number XM_001401056），產(chǎn)物經(jīng)純化后比活性為4127.3 U/mg。胡穩(wěn)奇等[6]從土壤中分離出一株米曲霉菌株，在實(shí)驗(yàn)室最適產(chǎn)酶條件下酶活達(dá) 6789.6 U/g。

運(yùn)用誘變、基因重組及發(fā)酵優(yōu)化手段來(lái)提高黑曲霉、宇佐美曲霉和米曲霉源的酸性蛋白酶的報(bào)道，比較常見(jiàn)，但白曲霉源的酸性蛋白酶相關(guān)的報(bào)道很少見(jiàn)。其中，李杰等[7]構(gòu)建了黑曲霉表達(dá)載體pSZHG-pepB，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉 CICC2462，其發(fā)酵產(chǎn)物酸性蛋白酶酶活達(dá)5543 U/mL。楊猛等[8]白曲是以麩皮為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定白曲的最佳配方，用此配方培養(yǎng)白曲36 h，酸性蛋白酶活力為l173 U/g。

本研究采用絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)，以經(jīng)基因工程改造的低內(nèi)源蛋白背景的無(wú)孢黑曲霉 SH-2為宿主，表達(dá)白曲霉酸性蛋白酶基因pepB，并且研究了表達(dá)產(chǎn)物的酶學(xué)性質(zhì)及酶活隨發(fā)酵pH的變化情況，為在釀酒工業(yè)中提高白曲酸性蛋白酶活力找到一個(gè)具有參考意義的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

黑曲酶SH-2和pMD18表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室改造并保存，pepB目的片段由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2 工具酶、試劑盒和試劑

PCR反應(yīng)預(yù)混酶 Prime STAR HS(premix)購(gòu)自TaKaRa公司；抗生素Amp購(gòu)自北京普博欣生物科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和質(zhì)粒大量提取試劑盒購(gòu)自廣州捷倍斯生物科技有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；福林酚試劑購(gòu)自北京普博生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

CD培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，NaNO33，KCl2，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.01，pH 5.5（固體含 1.7%瓊脂，液體含0.05%瓊脂）。

蔗糖高滲培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 400，NaNO33，KCl2，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.01，pH 5.5（軟瓊脂含0.5%瓊脂，固體含1.7%瓊脂）。

淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：玉米淀粉50，玉米漿30，豆粕粉20。

淀粉培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，酵母粉2，NaCl 2，可溶性淀粉5，pH 5.5。

1.1.4 引物

實(shí)驗(yàn)所用的引物如表1所示。

表1 引物Table 1 Primer

1.2 方法

1.2.1 pMD18-pepB表達(dá)載體構(gòu)建

表達(dá)載體圖譜如圖 1。以黑曲霉基因組為模板PCR擴(kuò)增糖化酶啟動(dòng)子PglaA，以廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成的pepB質(zhì)粒為模板擴(kuò)增 pepB片段。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；第30個(gè)循環(huán)72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳鑒定，將鑒定正確的PCR產(chǎn)物凝膠回收。PglaA、pepB、線性化后帶有表達(dá)元件的pMD18-T三片段在Infusion酶作用下進(jìn)行連接，55 ℃反應(yīng)，15 min后得到連接液。用熱激法將連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)Match1 T1，涂板于含有Amp抗生素的LB平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子液體LB培養(yǎng)12 h。然后進(jìn)行菌液PCR鑒定，挑取條帶正確的轉(zhuǎn)化子，送到廣州艾基生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

圖1 pMD18-pepB表達(dá)載體圖譜Fig.1 Map of pMD18-pepB expression vector

1.2.2 PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

黑曲霉常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法包括孢子電轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法等[9]。Meyer[10]對(duì)這些轉(zhuǎn)化方法的利弊進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，認(rèn)為孢子電轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率低。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雖具有轉(zhuǎn)化受體形式多樣、轉(zhuǎn)化效率較高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定、可轉(zhuǎn)移大片段、單拷貝比例高等優(yōu)點(diǎn)，但其操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化過(guò)程受多種因素影響。Michielse等[11]明確指出了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法在黑曲霉中的轉(zhuǎn)化效率較低。原生質(zhì)體PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化具有操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)，對(duì)黑曲霉菌株而言是較為有效的遺傳操作方法。李秀鵬[18]、許曉紅[12]用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在無(wú)孢黑曲SH-2中都得到了成功實(shí)踐。

原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化步驟詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9,13]。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)設(shè)置如下：實(shí)驗(yàn)組：將制得的原生質(zhì)體、pMD18-pepB質(zhì)粒和PEG緩沖液的轉(zhuǎn)化液加入到CD高滲軟瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻后，鋪在CD高滲培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)觀察。再生組：同實(shí)驗(yàn)組，唯一不同的是將CD高滲軟瓊脂培養(yǎng)基中預(yù)先加入尿嘧啶核苷，該實(shí)驗(yàn)組是檢驗(yàn)原生質(zhì)體的制備效果，30 ℃培養(yǎng)觀察。陰性組：同實(shí)驗(yàn)組，唯一不同的是將上述pMD18-pepB質(zhì)粒用無(wú)菌水代替，30 ℃培養(yǎng)觀察，記錄生長(zhǎng)情況。

1.2.3 轉(zhuǎn)化子鑒定

隨機(jī)實(shí)驗(yàn)組CD高滲培養(yǎng)基上至普通固體CD板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，5 d后挑取菌落，提取基因組，進(jìn)行PCR鑒定。鑒定引物設(shè)置三對(duì)：gyrG-F/gyrG-R、pepA-F/pepA-R、PglaA-F/PglaA-R之后將定位都正確的轉(zhuǎn)化子保種。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子發(fā)酵

發(fā)酵罐投料（30 L）：玉米漿3%、豆餅粉2%、玉米淀粉2%、麥芽糖漿（分消）3%、消泡劑 30 mL。除玉米漿和分消外，將原料投入發(fā)酵罐，調(diào)pH 6.0～6.2，加中溫淀粉酶和高溫淀粉酶，70 ℃保溫 20min，90 ℃保溫30 min，加入玉米漿，121 ℃～123 ℃，滅菌35 min。

發(fā)酵罐發(fā)酵相關(guān)參數(shù)：罐壓：0.05～0.06 MPa；罐溫：初始 34 ℃；轉(zhuǎn)速：200～800 r/min（根據(jù)溶氧可調(diào)）；溶氧：前期控制50%以上，中后期按最大轉(zhuǎn)速、風(fēng)量運(yùn)轉(zhuǎn)；pH：初始pH 5.5，當(dāng)pH降至4.5時(shí)，補(bǔ)氨控制在4.8。在發(fā)酵48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192 h、216 h、240 h發(fā)酵上清液5 mL，-20 ℃保存。

1.2.5 發(fā)酵初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，分裝于500 mL錐形瓶中，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH分別至4.5、5.5、6.5，115 ℃滅菌。分別接種液體CD培養(yǎng)的重組菌株菌液1 mL于淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)，分別在搖瓶24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h取發(fā)酵上清液5 mL，-20 ℃保存。

1.2.6 酶活測(cè)定與SDS-PAGE分析

采用Folin法測(cè)定蛋白酶酶活，以酪蛋白為底物，將其用乳酸緩沖液溶解，終濃度為10.0 g/L。反應(yīng)體系為4 mL，將1 mL酪蛋白溶液加入1 mL酶液中42 ℃條件下反應(yīng)10 min，加2 mL三氯乙酸終止反應(yīng)，對(duì)照組先向酶液中加入三氯乙酸以使酶失活。取過(guò)濾液1 mL加碳酸鈉溶液5.0 mL，再加福林試劑1 mL，42 ℃顯色20 min，于680 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。酶活定義：溫度42 ℃條件下，1 min水解酪素，產(chǎn)生1 μmol酪氨酸所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

重組轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清液清液40 μL，加入10 μL SDS loading，加熱煮沸5 min，取10 μL點(diǎn)樣，進(jìn)行4～20% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R 250染色，脫色后檢測(cè)目的蛋白條帶，分析重組蛋白分子量。SDS-PAGE電泳方法參考《分子克隆手冊(cè)》。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMD18-pepB表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

分別以黑曲霉基因組和含有pepB的質(zhì)粒為模板，PCR得到PglaA片段和pepB片段。PCR產(chǎn)物凝膠電泳如圖2所示，分別在1500 bp附近和1000 bp～1200 bp處擴(kuò)增出特異性條帶，與預(yù)期的PglaA片段（1500 bp）、pepB片段（1185 bp）大小相符。PglaA片段和pepB片段進(jìn)行重疊PCR，產(chǎn)物片段回收。PglaA、pepB和pMD18連接后轉(zhuǎn)入大腸感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，液體LB培養(yǎng)后，進(jìn)行菌液PCR，電泳結(jié)果如圖3，2號(hào)泳道菌液在10000 bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與pMD18-pepB質(zhì)粒（9380 bp）大小相符。將該菌液送廣州艾基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果無(wú)基因突變，表明pMD18-pepB表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以用于轉(zhuǎn)化曲霉。

圖2 PglaA片段和pepB片段PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of PglaA fragment and pepB fragment

圖3 菌液電泳Fig.3 Escherichia coli electrophoresis

2.2 轉(zhuǎn)化子鑒定

在絲狀真菌遺傳操作中，pyrG是常用的選擇性標(biāo)記，其編碼的乳清苷-5-磷酸脫羧酶（OMP）尿嘧啶核苷酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，pyrG缺失菌株不具備尿嘧啶核苷酸合成能力。宿主無(wú)孢黑曲SH-2是gyrG缺陷菌株，pMD18-pepB表達(dá)載體帶有pyrG，因此陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可以在不含尿嘧啶核苷的普通CD板上生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)10 d，從實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)化板上隨機(jī)挑陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，至普通 CD板。提取基因組，用三對(duì)引物pepB-F/pepB-R、PglaA-F/PglaA-R、gyrG-F/gyrG-R進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖4，對(duì)應(yīng)的pepB、PglaA、gyrG泳道分別在1000 bp～1200 bp、1400 bp～1600 bp、1000 bp～1200 bp處擴(kuò)增出了明亮的特異性條帶，這與預(yù)期的 pepB（1185 bp）、PglaA（1500 bp）gyrG（1100 bp）條帶大小相符，說(shuō)明目的基因表達(dá)框整合到了黑曲霉 SH-2基因組上。鑒定正確的轉(zhuǎn)化子用于發(fā)酵培養(yǎng)，以檢測(cè)目的蛋白。

圖4 轉(zhuǎn)化子PCR鑒定Fig.4 PCR identification of transformant

2.3 表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)

將定位正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在 30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，取48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192 h、216 h、240 h發(fā)酵上清液，稀釋 10倍后，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)及酶活測(cè)定。如圖5，SDS-PAGE分析，47 ku附近處均有條帶，與已知報(bào)道的酸性蛋白酶條帶相符[14,15]，這說(shuō)明白曲霉酸性蛋白酶與黑曲霉和宇佐美曲霉來(lái)源的酸性蛋白酶在分子量上沒(méi)有明顯差別。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，酸性蛋白酶條帶逐漸加深，并且酶活逐漸增加。在48 h～96 h內(nèi)，酶活增加較緩慢，96 h后酶活呈直線趨勢(shì)增加，在發(fā)酵240 h后，發(fā)酵粗酶液酶活達(dá)9972 U/mL。這與楊猛等[8]對(duì)白曲原始菌株進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)所得酸性蛋白酶酶活數(shù)據(jù)相比，酶活顯著提高，是原始菌株的 8.5倍。李杰等[7]用基因工程技術(shù)，使白曲酸性蛋白酶基因在黑曲CICC2462中得到了表達(dá)，重組菌株酶活為 5543 U/mL，與之相比，本實(shí)驗(yàn)所得的重組菌株酶活提高了79.9%，與文獻(xiàn)報(bào)道[5,6,16,17]的其他來(lái)源的酸性蛋白酶酶活數(shù)據(jù)相比，也存在一定的優(yōu)勢(shì)，這主要與本研究中采用的宿主有關(guān)。黑曲酶具有很強(qiáng)的糖化酶分泌能力，使得其內(nèi)源表達(dá)自身的糖化酶過(guò)程中，消耗掉很多中間代謝物和能量，同時(shí)過(guò)量表達(dá)的糖化酶會(huì)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等蛋白分泌途徑產(chǎn)生一定的壓力，若不能正確及時(shí)加工修飾成成熟蛋白分泌到胞外，將嚴(yán)重影響到其他蛋白的生成和分泌，限制外源蛋白的表達(dá)[18]。本研究中采用的宿主菌無(wú)孢黑曲SH-2，已敲除多拷貝糖化酶基因，為外源蛋白的表達(dá)提供了有力條件。同時(shí)，從重組菌株發(fā)酵液SDS-PAGE圖譜可以看出，其他分泌蛋白表達(dá)量很少，這為其作為添加菌用于釀酒工業(yè)提高白曲酸性蛋白酶酶活提供了可能。

圖5 白曲酸性蛋白酶SDS-PAGE分析及酶活測(cè)定Fig.5 Analysis of SDS-PAGE and enzymatic activity determination of acid protease

2.4 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 最適溫度

圖6 溫度對(duì)酶活的影響Fig.6 Effect of temperature on enzyme activity

水浴鍋設(shè)置 25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃ 7個(gè)溫度梯度。在pH恒定條件下，測(cè)定在不同催化溫度下的酶活。結(jié)果如圖6所示，最適反應(yīng)溫度為35 ℃，在25 ℃～55 ℃范圍內(nèi)，酶活都保持在60%以上。酸性蛋白酶的活性一般在50 ℃以下可以保持穩(wěn)定，但也隨產(chǎn)酶的微生物菌源不同而有所差異[19]。黑曲霉SL22-111所產(chǎn)酸性蛋白酶最佳反應(yīng)溫度為 50 ℃。低于 45 ℃或高于 60 ℃，酶活急劇下降，70 ℃時(shí)酶活性完全喪失[14]，米曲霉MTCC5341所產(chǎn)酸性蛋白酶最適溫度為55 ℃，在30 ℃～60 ℃時(shí)酶活力較穩(wěn)定[20]，宇佐美曲霉L336酸性蛋白酶最適溫度較高，在 60 ℃以上[21]。因此白曲酸性蛋白酶與其他來(lái)源酸性蛋白酶相比，最適反應(yīng)溫度偏低。

圖7 pH對(duì)酶活的影響Fig.7 Effect of pH on enzyme activity

2.4.2 最適pH

用K2HPO4和KH2PO4不同配比得到pH為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的磷酸緩沖液，然后用其稀釋酶液，并配成不同pH的1%酪蛋白底物，在恒定溫度下，測(cè)定酶活。結(jié)果如圖7，可以看出當(dāng)pH為4時(shí)，酶的活性最高，pH低于或高于4，酶活都會(huì)降低。pH值對(duì)白曲酸性蛋白酶活力影響非常顯著，pH值小幅下降會(huì)引起酶活迅速下降，當(dāng)pH值為2.5時(shí)，酶基本失活，這均與酶結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。與叢毛紅曲霉M.pilosus胞外酸性蛋白酶規(guī)律相似[22]，pH值改變導(dǎo)致酶蛋白空間構(gòu)象改變，甚至引起酶變性失活。在最適pH值時(shí)，酶的解離狀態(tài)往往是最有利于該酶與底物結(jié)合并發(fā)生催化反應(yīng)，使酶活力達(dá)到最大。袁康培等[23]對(duì)黑曲霉HU53酸性蛋白酶進(jìn)行研究，得出其最適反應(yīng)pH為3.0、曾黎明等[24]報(bào)道的米曲霉酸性蛋白酶最適pH為6.0，楊琥[5]對(duì)宇佐美曲霉酸性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究，表明其最適反應(yīng)pH為2.5。不同來(lái)源的酸性蛋白酶最適反應(yīng)pH不同，可能與其酶活性中心含有的羧基有關(guān)[25]。

2.4.3 金屬離子的影響

探究 Mn2+、Zn2+、Mg2+、Cd2+、Cu2+對(duì)酶活的影響，使以上各離子分別溶解于酶液中，終離子濃度為5 mmol/L。如圖 8，CK為空白對(duì)照組，可以看出，Mn2+、Cu2+對(duì)酶活有顯著的激活作用，酶活分別是對(duì)照組的3倍和2.5倍，Zn2+、Mg2+對(duì)酶活的影響作用不明顯，而Cd2+則對(duì)酶有明顯的抑制作用，使酶活低于對(duì)照組的 50%。戚淑威[15]研究的結(jié)果表明，Mn2+對(duì)該酶有明顯的激活作用，可使原始酶活提高2倍以上，張秀江[17]研究表明，在 5.0 mmol/L的濃度下，Mn2+對(duì)黑曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶有強(qiáng)烈的激活作用，達(dá)到對(duì)照酶活力的 150%?？梢?jiàn)，作為能顯著提高酸性蛋白酶酶活的金屬離子，Mn2+具有很大的應(yīng)用潛力。

圖8 金屬離子對(duì)酶活的影響Fig.8 Effect of ion types on enzyme activity

2.4.4 發(fā)酵初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，來(lái)研究pH對(duì)產(chǎn)酶的影響。

圖9 不同發(fā)酵初始pH下的酶活測(cè)定Fig.9 Determination of enzyme activity under different initial pH of fermentation

設(shè)置pH 4.5、pH 5.5、pH 6.5三個(gè)梯度，取24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h發(fā)酵上清液樣品。SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖9，a、b、c對(duì)應(yīng)的發(fā)酵初始pH條件分別為pH 4.5、pH 5.5、pH 6.5，d相應(yīng)的酶活測(cè)定?？梢钥闯?，在時(shí)間維度上，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，酸性蛋白酶表達(dá)量及酶活性逐漸增加。在初始pH 4.5～6.5范圍內(nèi)，提高發(fā)酵液初始pH，表達(dá)量及酶活性會(huì)有所增加。與方春玉等[4]、袁康培等[23]的報(bào)道相比偏高，這可能與宿主菌的生長(zhǎng)最適條件有關(guān)。本研究采用的宿主無(wú)孢黑曲SH-2最適生長(zhǎng)pH為5.5[18]，在其發(fā)酵過(guò)程中酸度會(huì)積累，從而解釋了發(fā)酵初始pH為6.5酶活會(huì)更高的情況。在酸性范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)卦黾又亟M菌株發(fā)酵液初始pH有利于酶活的提高。

3 結(jié)論

3.1 有關(guān)白曲酸性蛋白酶表達(dá)研究的報(bào)道比較少，本研究利用基因工程技術(shù)，使白曲霉酸性蛋白酶基因，在無(wú)孢黑曲SH-2中得到了表達(dá)。經(jīng)30 L發(fā)酵罐發(fā)酵240 h后，重組菌株發(fā)酵粗酶液酶活為9972 U/mL。酶活性質(zhì)研究表明，該酶的最適溫度為35 ℃，最適pH為 4，Mn2+、Cu2+對(duì)酶活有顯著的激活作用。在 pH 4.5～6.5范圍內(nèi)，適當(dāng)增大pH可以提高重組菌株在搖瓶發(fā)酵條件下酸性蛋白酶酶活。

3.2 本研究所用的宿主無(wú)孢黑曲SH-2經(jīng)過(guò)了糖化酶基因多拷貝的敲出，具有高表達(dá)、背景干凈的特點(diǎn)。重組菌株粗發(fā)酵液酶活是出發(fā)菌株酶活的8.5倍，與李杰等報(bào)道相比，酶活提高了 79.9%，與報(bào)道的其他來(lái)源的酸性蛋白酶表達(dá)也存在一定的優(yōu)勢(shì)，并且重組菌株背景單一，其他分泌蛋白表達(dá)量較少。因此，本研究所得的重組菌株有望用于白酒生產(chǎn)中調(diào)節(jié)糖化力和酸性蛋白酶活力的比例，來(lái)提高芝麻香酒的風(fēng)味。