程珂，肖香，趙延勝，周興華，董英

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

大麥是一種營養(yǎng)豐富并含有多種功能活性成分的谷物，全大麥食品是公認的人類“健康食品”[1]。發(fā)酵作為一種傳統(tǒng)的食品加工及貯藏方法，在降解食品原料中的有害物質(zhì)、控制致病菌生長的同時，還通過生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生如維生素﹑多肽、氨基酸﹑有機酸和脂肪酸等多種營養(yǎng)素和功能活性物質(zhì)[2～4]。大麥是乳酸菌發(fā)酵的良好基質(zhì)，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后，大麥中多肽、游離酚、可溶性膳食纖維等營養(yǎng)活性成分含量顯著提高[5]。Hole等[6]發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌發(fā)酵大麥粉后游離酚酸含量與生物利用率提高，Hong等[7]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵大麥飲料可以抑制白色脂肪組織增加，降低血脂及與食欲有關(guān)的激素水平，并改善胰島素敏感性。伍靜等[8]發(fā)現(xiàn)大麥乳酸菌發(fā)酵提取物抑制人結(jié)腸癌 HT-29細胞增殖。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)是一種重要的模式生物，成蟲長度約為 1 mm，身體透明，以大腸桿菌OP50為食。它具有結(jié)構(gòu)簡單、繁殖量大且周期短、易于人工培養(yǎng)、方便觀察等優(yōu)點，且脂肪代謝通路比較明確，與人類脂肪代謝通路相似，各關(guān)鍵代謝步驟的酶相似度較高[9]。近年來，食品領(lǐng)域很多研究者也使用該模式生物研究食物成分或提取物的功能活性[10,11]，尤其是在調(diào)節(jié)脂代謝及抗衰老等方面。Gao等[12,13]發(fā)現(xiàn)攝入大麥膳食纖維及燕麥制品后秀麗隱桿線蟲肥胖模型體脂減少，胰島素敏感性提高；Finleya等[14]也通過秀麗隱桿線蟲模型研究發(fā)現(xiàn)了不同豆類減少腸道脂肪沉積的功能。然而，國內(nèi)外尚未見利用秀麗隱桿線蟲肥胖模型研究發(fā)酵大麥提取物功能活性的報道。

本文建立秀麗隱桿線蟲肥胖模型以研究LFBE的功能活性。通過研究LFBE及其中各組分對肥胖秀麗隱桿線蟲脂肪沉積的影響，為進一步研究LFBE干預(yù)脂代謝的機制增添佐證，為發(fā)酵大麥健康功能食品的研發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

脫殼大麥購自鹽城市雙增農(nóng)化科技有限公司；植物乳桿菌(Lactobacillus plantarumdy-1；菌株編號：CGMCCNo.601)實驗室自行分離鑒定；秀麗隱桿線蟲N2野生型，由東南大學王大勇教授實驗室惠贈。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

冷凍離心機BR-4，法國JOUAN公司；真空冷凍干燥器，德國Marin Christ公司；體視顯微鏡，南京江南永新光學有限公司；多功能酶標儀，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；正置顯微鏡Ci-L，尼康光學儀器(中國)有限公司。

1.1.3 試劑

染色液：油紅O儲備液（購自國藥集團化學試劑有限公司）與蒸餾水3:2混合，過0.45 μm膜，現(xiàn)配現(xiàn)用；蛋白質(zhì)提取緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl，pH=7.5，2 mmol/L CaC12；M9緩沖液，NGM培養(yǎng)基，曲拉通X-100(Triton X-100)Sigma-Aldrich公司；其他生化試劑均為分析純，購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

植物乳桿菌發(fā)酵大麥提取物（LFBE）的制備：稱取篩分除雜后的新鮮大麥，粉碎后過100目篩，按大麥(m):水(V)=1:7的比例在錐形瓶中混合均勻。每克大麥加入0.25 mL第二次活化后的菌液后再次混勻，密封，32 ℃、150 r/min發(fā)酵24 h。4 ℃下8000 r/min離心15 min，取上清液-56 ℃凍干備用。

未發(fā)酵大麥提取物(RBE)的制備：大麥與水的比例同大麥乳酸菌發(fā)酵液的制備，但不加入植物乳桿菌，密封后處理同LFBE制備。

其中，LFBE與RBE主要活性成分含量分別為：蛋白質(zhì)含量 34.93%，13.93%；總糖含量 35.44%，64.94%；酚類化合物含量1.10%，0.91%。

1.2.2 總蛋白質(zhì)制備

采用緩沖液法，稱取一定量LFBE，4 ℃下緩沖液（VTris-HCI:V氯化鈣=1:1）提取30 min，4000 r/min離心10 min取上清液，重復(fù)兩次，合并上清液真空冷凍干燥，即得到發(fā)酵大麥提取物中總蛋白質(zhì)。

1.2.3 總糖制備

準確稱取LFBE 1 g，溶于25 mL蒸餾水后沸水浴1 h，冷卻至室溫，4000 r/min下離心10 min收集上清液，定容至50 mL。加入4倍體積無水乙醇，混勻后4 ℃靜置過夜，4000 r/min下離心10 min棄上清液，沉淀用數(shù)毫升80%乙醇潤洗，反復(fù)操作3～4次，最后將沉淀用水充分溶解備用。

將上述所得總糖溶液與 Sevage液[V(氯仿):V(正丁醇)=4:1]按1:1體積比混合，振搖10 min，分液漏斗中靜置2 h，收集上層溶液，重復(fù)操作8～10次，將收集的溶液真空冷凍干燥，得到發(fā)酵大麥提取物的總糖備用。

1.2.4 酚類化合物制備

準確稱取0.5 g LFBE溶于10 mL水，用6 M的鹽酸溶液將pH調(diào)至1.3～1.5，再用20 mL乙酸乙酯萃取，重復(fù)四次，取有機相合并后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，收集殘渣溶于甲醇/水（25:75，V/V）。

1.2.5 平板涂布

配制NGM固體培養(yǎng)基，包括正常固體培養(yǎng)基及含1 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基。

分別配制3.2 mg/mL的RBE和LFBE溶液為母液。將母液分別稀釋0、2、4、8倍，并與活化后的大腸桿菌OP50菌液1:1混合，涂布于含1 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基上，20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h待用。

分別配制960 μg/mL，960 μg/mL 及32 μg/mL 的蛋白質(zhì)，總糖及酚類化合物溶液（即相當于濃度為3.2 mg/mL的LFBE溶液中三種成分含量的濃度），稀釋0，2，4倍后與菌液混合涂布并培養(yǎng)待用。

1.2.6 線蟲培養(yǎng)

線蟲培養(yǎng)至板上有大量產(chǎn)卵期的成蟲，進行同步化，緩沖液M9中孵育至L1期，離心棄上清液，留下約100 μL液體，轉(zhuǎn)移至正常平板，培養(yǎng)至L4期，轉(zhuǎn)入加樣平板中培養(yǎng)至成蟲。

1.2.7 油紅O染色

培養(yǎng)皿中加入S液2 mL，移取線蟲至離心管中，3000 r/min離心1 min 30 s，棄上清，重復(fù)至少兩遍，加入500 μL 60%異丙醇，4000 r/min離心3 min，棄上清，加入500 μL油紅O染色液，室溫（25 ℃）避光靜置6～18 h，離心棄上清。S液洗一遍，離心棄上清，加入0.01% Triton-X100 250 μL，正置顯微鏡下拍照，得到油紅O染色圖。

離心后加入M9緩沖液，轉(zhuǎn)移至新的離心管，5000 r/min離心1 min，去除M9；加入200 μL無水乙醇，混合搖晃5 min，5000 r/min離心1 min，取上清液測510 nm下的吸光值。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用專業(yè)圖像處理軟件image-J處理染色圖，用spss進行顯著性分析，OriginPro進行統(tǒng)計學分析并作圖，結(jié)果以平均值±標準方差表示，顯著性以p＜0.05計。

2 結(jié)果與討論

2.1 RBE與LFBE對秀麗隱桿線蟲脂肪含量的影響

圖1 油紅O染色圖Fig.1 oil red O staining figure

秀麗線蟲的脂肪主要以脂滴形式儲存于腸道及皮下組織，而油紅O為脂溶性染料，可特異性的附著在中性脂肪分子上形成醒目的紅色，故可用來觀察秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的脂肪沉積情況。如圖1所示，與正常組相比，模型組與RBE組紅色較深且染色面積較大，而LFBE組的紅色較淺且面積較小，與正常組更接近，說明攝入 LFBE能降低線蟲體內(nèi)脂肪含量，而攝入RBE則沒有顯著效果。

定量分析（圖2，圖3）則反映了油紅O染色處理的吸光值與脂肪含量的關(guān)系，測得值越大說明線蟲體內(nèi)脂肪沉積的越多。結(jié)果顯示，RBE組脂肪沉積量高于模型組，說明其在試驗的范圍內(nèi)，RBE不僅沒有降低脂肪沉積量，反而促進了脂肪的積累。而 LFBE在濃度較低時，對線蟲體內(nèi)脂肪沉積量無明顯影響，但當濃度為800 μg/mL、1600 μg/mL時，LFBE顯著降低線蟲體內(nèi)脂肪沉積量，與模型組相比，分別降低了13%和26%。

圖2 RBE濃度對秀麗隱桿線蟲脂肪沉積量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of RBE on fat deposition of C.elegans

圖3 LFBE濃度對秀麗隱桿線蟲脂肪沉積量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of LFBE on fat deposition of C.elegans

乳酸菌發(fā)酵后谷物中蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量下降，多肽含量提高，游離酚酸，尤其是阿魏酸的含量有顯著提高，這可能是導致LFBE具有更顯著降脂活性的主要原因。史臘妮等[15]發(fā)現(xiàn) LFBE有效抑制 3T3-L1前脂肪細胞的增殖，并能顯著抑制脂代謝關(guān)鍵基因C/EBPα、PPAR-γ、SREBP-1c、PTP1B和aP2的mRNA表達水平，上調(diào)GLUT4的mRNA表達水平，張家艷等[16]發(fā)現(xiàn)LFBE具有調(diào)節(jié)肥胖大鼠脂代謝及改善胰島素抵抗的作用，與本研究LFBE對秀麗隱桿線蟲的降脂試驗結(jié)果相一致。

2.2 LFBE中總蛋白質(zhì)對秀麗隱桿線蟲脂肪沉積的影響

圖4 不同濃度蛋白質(zhì)對秀麗隱桿線蟲脂肪沉積量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of protein on fat deposition of C.elegans

如圖4所示，LFBE中總蛋白質(zhì)能顯著降低秀麗線蟲體內(nèi)脂肪沉積量，且隨著蛋白質(zhì)濃度升高，秀麗線蟲脂肪沉積量下降。當?shù)鞍踪|(zhì)濃度為120、240、480 μg/mL時，線蟲脂肪沉積量與模型組相比分別下降了12%、14%和26%。這說明蛋白質(zhì)是LFBE中抑制秀麗線蟲脂肪沉積的活性組分。

研究表明，大麥經(jīng)發(fā)酵后，其蛋白質(zhì)分子量減小，多肽含量升高，具有更顯著的生物活性。目前探討蛋白質(zhì)對秀麗線蟲脂肪沉積影響的報道較少，但在動物與細胞模型中，發(fā)酵谷物中蛋白質(zhì)或多肽的降脂功能已經(jīng)得到了驗證。史臘妮等[15]研究發(fā)現(xiàn)，LFBE中總蛋白能顯著抑制 3T3-L1前脂肪細胞的增殖與分化，并能夠通過調(diào)控相關(guān)基因的表達對脂肪細胞胰島素通路進行調(diào)節(jié)，與本試驗結(jié)果相吻合，表明LFBE中的蛋白質(zhì)具有降脂效果。

2.3 LFBE中總糖對秀麗隱桿線蟲脂肪沉積的影響

如圖5所示，當總糖濃度為120 μg/mL時，線蟲脂肪沉積量與模型組接近，基本不具有降脂效果；而濃度為240 μg/mL時，脂肪沉積量降低9%，但不具有顯著性；當總糖濃度達到480 μg/mL時，秀麗線蟲體內(nèi)脂肪沉積量與模型組相比下降12%，接近正常組水平。這一結(jié)果表明LFBE中的總糖在一定濃度下也具有降低秀麗隱桿線蟲脂肪沉積的效果。

研究表明，谷物中的多糖尤其是膳食纖維具有降脂作用，而膳食纖維的降脂作用與其在腸道中的發(fā)酵產(chǎn)物相關(guān)。Jolene等[17]通過尼羅紅染色發(fā)現(xiàn)，攝入抗性淀粉后，秀麗線蟲的脂肪含量與對照組相比下降至76.5%，而經(jīng)過小鼠腸道發(fā)酵的抗性淀粉產(chǎn)物能使秀麗線蟲的脂肪沉積量下降至78.8%。Abdeltawab等[18]通過臨床試驗證實添加大麥β-葡聚糖的主食可以降低餐后血糖與體重，且另有研究發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖需要達到一定濃度才能抑制前脂肪細胞分化[19]。本研究中，總糖達到一定的濃度才具有顯著的降脂作用，可能與其中β-葡聚糖含量是否達到產(chǎn)生降脂活性的濃度有關(guān)。

圖5 不同濃度總糖對秀麗隱桿線蟲脂肪沉積量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of polysaccharide on fat deposition of C.elegans

2.4 LFBE中酚類化合物對秀麗隱桿線蟲脂肪沉積的影響

圖6 不同濃度酚類化合物對秀麗隱桿線蟲脂肪沉積量的影響Fig.6 Effects of different concentrations of polyphenol compounds on fat deposition of C.elegans

如圖6所示，LFBE中酚類化合物能顯著降低秀麗線蟲體內(nèi)脂肪沉積量，且隨著酚類化合物濃度升高，秀麗線蟲脂肪沉積量下降。當酚類化合物濃度為4、8、16 μg/mL時，線蟲脂肪沉積量與模型組相比分別下降了21%、24%和39%。相同濃度LFBE中含有的酚類化合物與蛋白質(zhì)和總糖相比降脂作用更加明顯，說明酚類化合物是LFBE中主要的降脂功能活性組分。

研究表明，谷物中的酚類化合物能降低大鼠脂肪含量，有效抑制 3T3-L1脂肪細胞分化，且經(jīng)過發(fā)酵后，谷物多酚的降脂作用更加顯著。

同時，利用線蟲模型對酚類化合物的研究也表明了其對線蟲脂肪沉積的抑制作用。Sun等[20]發(fā)現(xiàn)含有大量酚類化合物的蔓越莓提取物作用于線蟲，可使其脂肪沉積量顯著下降，且通過不同突變型線蟲的研究，認為酚類化合物的降脂效果可能是源于對sbp-1，cebp及nhr-49等基因的表達量的調(diào)控。因此，可以推測酚類化合物在LFBE抑制秀麗線蟲脂肪沉積的過程中起主要作用，但其發(fā)揮作用的分子機制有待進一步的研究。

3 結(jié)論

LFBE具有減少秀麗隱桿線蟲肥胖模型脂肪沉積量的功能，且以其中的酚類化合物作用最為明顯，總蛋白質(zhì)次之。當LFBE濃度達到800 μg/mL以上時，顯著抑制秀麗線蟲肥胖模型脂肪的沉積。其中，總蛋白濃度為120 μg/mL，酚類化合物濃度為4 μg/mL時，即具有顯著的降脂活性，而總糖濃度需達到 480 μg/mL，方能顯現(xiàn)其降低脂肪沉積的作用。