褚建祎，陳瑩

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；2.31697部隊，遼寧 大連 116000)

在臨床診斷過程中，對早期病變患者的病理信息診出率不足，獲取的信息單一，可能導(dǎo)致治療策略的遺漏或失誤；另在治療過程中，復(fù)雜手術(shù)環(huán)境下對病灶和正常組織難以實現(xiàn)精準(zhǔn)區(qū)分定位，以及無法及時獲取形變狀態(tài)，都導(dǎo)致了治療方法與范圍的誤差，降低手術(shù)成功率與預(yù)后效果。這種種的臨床需求都迫切地要求臨床的診斷方式要從過去的相互獨立、單一化向一體化、多樣化趨勢發(fā)展[1]。磁共振成像技術(shù)(Magnetic Resonance Imaging，MRI)作為臨床醫(yī)學(xué)影像診斷方面最常用手段具有三維高質(zhì)量軟組織成像，高空間分辨率和無放射性損傷等優(yōu)點，但是其靈敏度較差，很難發(fā)現(xiàn)較小的病灶[2-3]。而熒光成像(FluoresenceImaging/FI)具有極高的靈敏度，可以在手術(shù)和治療過程中提供實時清晰的成像，但是其空間分辨率較差，穿透性不足。因此將MRI與FI兩種成像模式結(jié)合，便可提供充足和完整的醫(yī)學(xué)信息，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。

二氧化硅由于其出色的理化性質(zhì)，如良好的水溶性、高的透光性、化學(xué)惰性、以及表面容易修飾基團可用于連接多種生物分子等，引起了人們廣泛地關(guān)注。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，近幾年，硅包覆QDs和Fe3O4的復(fù)合粒子(Fe3O4-QDs/SiO2)的合成及應(yīng)用已成為了多功能磁性熒光復(fù)合納米粒子的研究熱點之一[4]。本文擬利用反相微乳法制備超小Fe3O4-QDs/SiO2復(fù)合納米粒子，由于Fe3O4-QDs/SiO2復(fù)合納米粒子兼具出色的熒光和磁性信號，并能夠有效地防止量子點等納米粒子的泄露等優(yōu)點，因此其作為造影劑可同時用于高空間的MRI和高靈敏的FI的雙模態(tài)成像。

1　材料與方法

1.1儀器與試藥硼氫化鈉、碲粉(99.99%)、氯化鎘、巰基丁二酸(MSA)、六水合三氯化鐵、四水合二氯化鐵、四甲基氫氧化銨(TMAH)、曲拉通X-100、正己醇、聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽、四甲基硅烷絡(luò)合物等均購買于Sigma-Aldrich公司，纖維素透析袋(截留分子量：5000)及尼龍超濾膜(孔徑：0.2 μm)購買于Spectrum Labs公司。Fe3O4-QDs/SiO2納米粒子的形貌和尺寸通過FEI Tecnai G2型透射電子顯微鏡進行觀察。將制備好的納米粒子的懸浮液超聲分散后，取一滴滴于銅網(wǎng)上，自然干燥。Hitachi U4100 UV Spectrometer紫外光譜儀和F-2700熒光分光光度計用于記錄Fe3O4-QDs/SiO2納米粒子的紫外光譜和熒光光譜。振動樣品磁強計用來機率Fe3O4-QDs/SiO2納米粒子的磁化強度，同時Magnetom Verio 3.0 TMRI 掃描儀(Siemens，德國)對Fe3O4-QDs/SiO2納米粒子進行體外MRI成像研究。

1.2方法

1.2.1水相CdTe量子點的合成采用水熱法合成水相CdTe量子點。稱取80 mg 的硼氫化鈉，將其放于一個通氮除氧后的密閉小燒瓶中，然后向其中加入1 mL的去離子水，再加入127.5 mg的碲粉。在小燒瓶上方留一可以排氣的小孔，以便排除反應(yīng)所產(chǎn)生的氫氣。在常溫下電磁攪拌反應(yīng)4 h，產(chǎn)生白色的NaHTe中間體。按照摩爾比Cd2+/MSA/NaHTe=1∶2.4∶0.5的比例，將NaHTe溶液加入到通氮去氧后、混有巰基丁二酸(MSA)的CdCl2溶液中。然后將混合溶液加入到反應(yīng)釜中，在160 ℃下反應(yīng)45 min，制備出最大發(fā)射波長為635 nm，摩爾濃度為2 mM，巰基丁二酸修飾的CdTe量子點。

單分散的超順磁性四氧化三鐵納米粒子由化學(xué)共沉淀法制備，首先將六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)，四水合二氯化鐵(FeCl2·4H2O)按照摩爾比Fe3+∶Fe2+=2∶1加入到已通N230 min的盛有100 mL水的三頸瓶中。保持通N2 并劇烈攪拌，此時緩慢加入12 mL氨水(25%)。30 min后，停止反應(yīng)，用磁鐵將黑色的Fe3O4生成物從水溶液中分離，用蒸餾水反復(fù)洗滌3次。然后加入適量的四甲基氨TMA對四氧化三鐵進行修飾，超聲1 min，搖勻，分散在10 mL去離子水中備用。最終所制備的Fe3O4納米粒子濃度約為10 mM。

1.2.2制備Fe3O4-CdTeQDs/SiO2復(fù)合納米粒子Fe3O4-CdTeQDs/SiO2復(fù)合納米粒子是在室溫下由反相微乳法制得。在合成過程中，環(huán)己烷作為連續(xù)相，曲拉通X-100作為表面活性劑和正己醇作為助表面活性劑。當(dāng)水相的CdTe和Fe3O4納米粒子加入后，攪拌形成微乳液(W/O)體系，在堿性條件下，正硅酸乙酯TEOS在油水界面進行水解，從而將水相的CdTe和Fe3O4納米粒子包覆在二氧化硅殼中。在本實驗中，將7.5 mL環(huán)己烷，1.77 mL曲拉通X-100，1.8 mL正己醇，100 μL合成的Fe3O4納米粒子溶液，400 μL CdTe量子點水溶液，60μL聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽PDDA 水溶液(0.075% v/v)和100 μL的TEOS混合，攪拌30 min，形成均勻的微乳液體系。然后將60 μL濃度為28%的NH4OH加入到微乳液體系中，在堿性條件下，TEOS開始水解反應(yīng)。室溫下，避光反應(yīng)24 h后，20 mL丙酮溶液加入到錐形瓶中進行破乳，即所得Fe3O4-CdTeQDs/SiO2復(fù)合納米粒子。最后，分別用異丙醇，乙醇，水清洗復(fù)合納米粒子。

1.2.3功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子穩(wěn)定性測試將制備的Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子溶于pH=7.4的PBS溶液中，將其置于室溫下進行放置，利用動態(tài)光散射儀分別對1、3、5、7、14、21 d時對溶液中納米粒子的水合離子半徑進行測量，反映功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2納米粒子的聚集狀態(tài)，從而檢驗納米粒子的穩(wěn)定性。

1.2.4MRI成像配置不同濃度的Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子，按照鐵離子濃度分別為0.02、0.05、0.1 mM，同時用水做對照劑。利用Magnetom Verio 3.0 T MRI 掃描儀對樣品進行MRI的T2加權(quán)成像。

2　結(jié)　　果

2.1功能Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的形貌與性質(zhì)分析

功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的形貌與粒徑可通過TEM 進行觀察，如圖1所示。功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的形態(tài)規(guī)則，粒徑均勻分布，二氧化硅成功地包覆了Fe3O4和CdTeQDs納米粒子具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)，呈球形，大小約為50 nm 左右。有較強的尺寸優(yōu)勢和高的表面積。另外，通過氨基化硅烷絡(luò)合劑，使其表面成功連接活性的氨基基團，使其保持活性可以與多種生物分子進行相連，且具有極好的水溶性。

另通過激光粒度儀對其穩(wěn)定性的研究表明(見圖2)，F(xiàn)e3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的水合半徑，在室溫及普通光照下，能夠穩(wěn)定存在超過2 w。在測定期間內(nèi)，功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的水合半徑?jīng)]有明顯變化，表明表面氨基修飾能夠有效的防止納米粒子因表面積造成的團聚，顯示了較好的穩(wěn)定性。

圖1　功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2納米粒子的電子透射電鏡TEM成像圖2　室溫下不同時間內(nèi)功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2納米粒子水合離子半徑檢測

2.2功能Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的熒光和超順磁性性質(zhì)分析

功能Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的熒光發(fā)射光譜如圖3所示，從圖中可以看出，F(xiàn)e3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子發(fā)射波長在653 nm，且顯示了杰出的熒光性質(zhì)，較大的Stock’s位移和窄而對稱的發(fā)射光譜，這使其作為一種FI造影劑在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上可提供事實的高靈敏的熒光成像，具有廣泛而深遠的應(yīng)用前景。另通過磁滯回線(見圖4)可以看出Fe3O4-CdTeQDs/SiO2具有較好的超順磁性和可忽略的剩磁與矯頑力。其飽和磁強比達到了20.1 emu/g，顯示了較好的超順磁性，這為其作為T2加權(quán)MRI造影劑奠定了理論基礎(chǔ)。

圖3　功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2納米粒子的熒光光譜圖4　功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2納米粒子的磁滯回線

2.3功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的體外T2加權(quán)MRI成像

磁共振顯影劑是磁共振成像的基礎(chǔ)，造影劑的使用，可有效地改變病變組織中質(zhì)子的自旋-自旋弛豫時間，從而有效地增強對比度。不同濃度的功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的體外T2加權(quán)MRI成像如圖5所示。T2加權(quán)MRI成像的使信號值的逐漸減弱顯暗色，其中作為對照劑，水的信號強度很高，對應(yīng)的T2加權(quán)MRI 成像呈亮色，這與水分子的反磁性性質(zhì)相對應(yīng)。而作為造影劑，功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子溶液的 MRI 圖像顯暗色，對應(yīng)的造影強度與其濃度表現(xiàn)出明顯的依靠關(guān)系，隨著濃度逐漸增大，對比的MRI成像暗度增加，信號逐漸減弱。這說明制備的功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子作為T2加權(quán)造影劑可以明顯縮短縱向馳豫時間T2，并隨著功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子濃度的增加縮短顯著。

圖5功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2納米粒子的體外T2加權(quán)MRI成像

3　討　　論

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，基于磁性Fe3O4納米粒子和熒光探針的磁性熒光復(fù)合納米粒子收到了廣泛地關(guān)注。作為一種新型的多功能雙模式造影劑(Contrast agents)，其不僅具有磁性納米粒子的磁靶向、傳遞、細胞分離、MRI等特性，同時將熒光示蹤特性融入其中，可以用作熒光基礎(chǔ)的生物標(biāo)記和熒光成像。將FI與MRI相結(jié)合，可提供更加立體和清晰的醫(yī)學(xué)成像，更深一步為重大疾病早期診斷和手術(shù)提供依據(jù)和幫助。有報道稱，在不遠的未來，結(jié)合了磁性和光學(xué)特性的復(fù)合納米粒子將使生物醫(yī)學(xué)研究取得重大突破[5]。到目前為止，F(xiàn)e3O4與多種有機熒光染料聯(lián)合共同用于MR/FI 雙模式成像已經(jīng)有過報道[6-7]，但由于有機染料易光漂白和不穩(wěn)定，導(dǎo)致這些雙成像造影劑的應(yīng)用受到很大限制。熒光量子點(Quantum dots/QDs)作為新一代的熒光探針，由于其獨特的光學(xué)尺寸依賴特性、寬的激發(fā)波長、窄的發(fā)射光譜、出色的光穩(wěn)定性和抗光漂白性，已經(jīng)在在分子標(biāo)記、免疫分析、生物成像、離子檢測等方面得到了廣泛的應(yīng)用[8]。對于磁性熒光復(fù)合納米體系的制備和應(yīng)用，ShiDL研究組曾用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)包覆磁性聚苯乙烯微球和QDs制備了多功能的納米體系[9]；Zhang HX 研究組制備了殼聚糖包覆QDs和Fe3O4的納米凝膠，在其表面修飾了葉酸分子后，對其在人肺癌細胞A549內(nèi)的毒性、細胞成像、靶向給藥及在小鼠內(nèi)的磁靶向聚集等性能進行了考察[10]。Sun JQ教授等人用聚烯丙胺鹽酸鹽與葡聚糖的聚微凝膠包覆磁性Fe3O4納米粒子，并通過化學(xué)鍵連接CdTe QDs量子點，制備了復(fù)合的磁性熒光納米體系[11]。在上述方法中，均直接使用聚合物材料對Fe3O4及QDs進行包覆，這導(dǎo)致了當(dāng)復(fù)合納米粒子用于細胞或活體成像時，隨著造影劑在體內(nèi)的聚集和循環(huán)，QDs及Fe3O4納米粒子很容易從復(fù)合納米粒子中泄露出來，從而對周邊細胞及組織產(chǎn)生毒性(如量子點泄露會產(chǎn)生游離的重金屬離子，造成的重金屬中毒)，故上述已報到的磁性熒光復(fù)合納米粒子在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用受到很大的限制。

為了解決上述問題，本文通過反相微乳法一步制備了功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子，通過系統(tǒng)地研究表明，功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子具有杰出的分散性，核殼結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性和較強的熒光和超順磁性，由于表面的二氧化硅的包覆可以有效地避免QDs及Fe3O4納米粒子泄露給生物體環(huán)境所帶來的影響。通過體外的T2加權(quán)MRI成像，證明了我們所制備的Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子可以作為一種出色的造影劑用于未來的MRI/FI成像研究。