，，，，

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018)

0　引　言

豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus, PCV)是最小的動(dòng)物DNA病毒之一[1]，最早由德國學(xué)者Tischer在豬腎細(xì)胞系PK-15中被當(dāng)作一種細(xì)胞污染物[2]，其病毒粒子主要以二十面體對(duì)稱，無囊膜為主要特征，直徑約17 nm。PCV基因組以滾環(huán)模式復(fù)制，大小約為1.7～2.0 kb，為單股環(huán)狀閉合DNA。根據(jù)其核苷酸序列和致病性不同，PCV被分為PCV1、PCV2 和PCV3。PCV1無致病性，PCV3為新發(fā)現(xiàn)的一種豬圓環(huán)病毒，可能與垂直傳播或?qū)е履肛i繁殖障礙疾病有關(guān)[3-5]。Allan等[6]從豬群中分離并確認(rèn)PCV2為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原，其主要影響6～8周斷奶仔豬，通常表現(xiàn)為消瘦、呼吸困難和免疫抑制[7-8]。PCV2還可誘導(dǎo)豬皮炎與腎炎，繁殖障礙和呼吸道綜合征等疾病的綜合感染[9]。

PCV基因組中大于200 nt的開放閱讀框(Open reading frame, ORF)有6個(gè)[10]，已全部鑒定完畢。ORF1是其中最大的開放閱讀框，編碼啟動(dòng)病毒復(fù)制的Rep蛋白，為PCV2的DNA復(fù)制、相關(guān)蛋白表達(dá)及病毒粒子的產(chǎn)生所必需，不同PCV毒株ORF1的核苷酸同源性高達(dá)80%以上[11]；ORF2位于病毒基因組互補(bǔ)鏈，編碼病毒的核衣殼蛋白Cap，是目前唯一已知的結(jié)構(gòu)蛋白，不同PCV毒株的核苷酸同源性為63%左右[12-13]。Cap蛋白具有免疫原性，存在多個(gè)免疫反應(yīng)區(qū)，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體，是PCV2最重要的亞單位疫苗抗原[14]。ORF3編碼一種非病毒復(fù)制必需的非結(jié)構(gòu)蛋白，通過構(gòu)建ORF3缺失株證實(shí)ORF3蛋白能導(dǎo)致PK-15細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]，ORF4編碼60個(gè)氨基酸，與ORF1和ORF3基因重疊，編碼方向與ORF1相反，ORF4蛋白具有凋亡抑制功能但非病毒復(fù)制必需[16-17]。ORF5可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路在PCV2持續(xù)性感染中起重要作用[18]。PCV2的ORF6蛋白對(duì)病毒復(fù)制是非必需的，可能參與Caspase調(diào)控和多個(gè)細(xì)胞因子表達(dá)[19]。

目前，PCV2的分子致病機(jī)制尚未研究清楚。為進(jìn)一步研究PCV2基因組結(jié)構(gòu)與功能、致病機(jī)制和免疫機(jī)理，本文通過PCR擴(kuò)增PCV-2全基因組，構(gòu)建自環(huán)化PCV-2全基因組DNA，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)染細(xì)胞，成功獲得拯救病毒PCV2。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1毒株與細(xì)胞

PCV2細(xì)胞株(PCV2-SY)由揚(yáng)州大學(xué)高崧教授提供；不攜帶PCV的PK-15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2載體與菌株

pMD18-T連接試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司，大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和pBluescript SK(pSK)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP、膠回收試劑盒、相關(guān)引物、DMEM高糖培養(yǎng)基均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、T4 DNA連接酶、南美胎牛血清、細(xì)胞胰酶消化液(含酚紅)和Lipo 6000TM轉(zhuǎn)染試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司。

1.2　引物設(shè)計(jì)

從美國國家生物技術(shù)信息中心(National center for biotechnology information, NCBI)網(wǎng)站下載PCV2全基因組序列并對(duì)序列進(jìn)行同源分析，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)用于檢測(cè)PCV2的特異引物，以及一對(duì)擴(kuò)增基因組全長的引物，并引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)，以利于下游基因操作，本研究所用引物如表1所示。

表1　本研究所用引物序列

注：PCV2的Cap蛋白轉(zhuǎn)錄正常剪接擴(kuò)增產(chǎn)物大小為486 bp，基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物則為878 bp。

1.3　PCV2株全基因組克隆

以用常規(guī)方法提取感染病毒細(xì)胞總DNA為模板，利用PCV2特異性引物TF1094和TR1471進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)首先在 94 ℃進(jìn)行預(yù)變性5.0 min；接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸5.0 min。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。以上述總DNA為模板，利用GF1358和GR1363引物對(duì)進(jìn)行PCV2全基因組克隆。除PCR擴(kuò)增延伸時(shí)間延長至1.5 min外其它反應(yīng)參數(shù)同上。將PCR產(chǎn)物回收后與pMD?18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)挑取單菌落，提取并將酶切鑒定的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.4　pSK-PCV2重組質(zhì)粒構(gòu)建

將測(cè)序正確的pMD-PCV2質(zhì)粒用XbaⅠ酶切，凝膠電泳分離PCV2片段，把回收的 PCV2 DNA與pSK質(zhì)粒用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，提取質(zhì)粒送公司測(cè)序。

1.5　病毒雙鏈裸DNA制備及轉(zhuǎn)染

提取質(zhì)粒并用XbaⅠ內(nèi)切酶做酶切鑒定，將切下的目的片段用T4 DNA連接酶自環(huán)化，獲得病毒雙鏈環(huán)化DNA。按照Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將鑒定正確的環(huán)化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，并在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，反復(fù)凍融3次后收集上清液，接種于新培養(yǎng)的 PK-15細(xì)胞并連傳15代。

1.6　病毒體外轉(zhuǎn)錄鑒定

根據(jù)RNAiso TM Plus說明書提取總RNA，并用DNase Ⅰ處理，以除去混有RNA的少量病毒DNA，以純化后的RNA為模板，利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再用引物對(duì)CapR466和GF1358進(jìn)行PCR。除循環(huán)次數(shù)增加到35個(gè)外，其它擴(kuò)增條件同1.3。用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.7　間接免疫熒光檢測(cè)

將傳代培養(yǎng)15代的接毒細(xì)胞消化分裝于6孔板，每孔注入3.0×105個(gè)細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后用PBS緩沖液洗滌，拍干，通過100%甲醇固定細(xì)胞10.0 min，棄去固定液，用PBS清洗兩次后以抗PCV2的ORF2兔多抗為一抗，37 ℃作用1 h，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔熒光二抗(1∶1000稀釋)為二抗，37 ℃作用1 h，每孔加入1滴磷酸甘油封片液，熒光顯微鏡觀察，以正常PK15細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

2　結(jié)果與分析

2.1　PCV2全基因組克隆及序列分析

以細(xì)胞毒總DNA為模板，用PCV2全長引物對(duì)GF1358/GR1363擴(kuò)增到約1.8 kb目的片段，結(jié)果如圖1所示。將純化的目的片段克隆到pMD18-T獲得pMD18-PCV2，陽性克隆經(jīng)過EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。測(cè)序結(jié)果顯示，本研究獲得PCV2毒株基因組全長序列為1767 bp，將該序列與國內(nèi)外27個(gè)代表性PCV2毒株進(jìn)行序列比較，結(jié)果表明同源性在95.4%～99.9%之間，不存在明顯特殊變異，與GQ996404的親緣關(guān)系最密切，同源性達(dá)99.9%(圖3)。

M：DL 2 000 DNA Marker; 1：未接毒PK-15細(xì)胞總DNA；2：接毒PK-15細(xì)胞總DNA圖1　PCV2全基因組擴(kuò)增檢測(cè)照片

M：1 kb DNA Ladder；1-4：重組質(zhì)粒EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切圖2　重組質(zhì)粒EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定照片

2.2　pSK-PCV2重組質(zhì)粒構(gòu)建

質(zhì)粒pMD-PCV2經(jīng)XbaⅠ限制性內(nèi)切酶37 ℃酶切，回收目的片段，并與pSK載體連接獲得重組質(zhì)粒pSK-PCV2，將其再次經(jīng)XbaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，產(chǎn)生與預(yù)期相符的1767 bp和2961 bp目的片段，結(jié)果如圖4所示，表明PCV2全基因組成功克隆至載體pSK。

圖3　PCV2-SY毒株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

M： DNA Marker；1： Xba Ⅰ酶切產(chǎn)物圖4　pSK-PCV2酶切鑒定照片

2.3　病毒自環(huán)化及轉(zhuǎn)染

XbaⅠ酶切重組質(zhì)粒并經(jīng)凝膠電泳鑒定正確后，回收PCV2全基因組酶切產(chǎn)物并用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，形成自環(huán)病毒DNA。重組病毒持續(xù)盲傳15代，每一代都進(jìn)行病毒液回收并再次感染新的PK15細(xì)胞，再對(duì)回收的病毒液提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。圖5為盲傳第10代PCR檢測(cè)結(jié)果，自環(huán)化重組病毒和野毒均產(chǎn)生378 bp大小目的PCR產(chǎn)物，但pBluescript SK-PCV2轉(zhuǎn)染細(xì)胞和PK-15細(xì)胞無陽性產(chǎn)物，表明自環(huán)化重組病毒已成功轉(zhuǎn)染并可在PK15細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行穩(wěn)定復(fù)制傳代。

M： DNA Marker；1：空白陰性對(duì)照；2：野生PCV2；3：重組PCV2；4：pSK-PCV2轉(zhuǎn)染PK15陰性細(xì)胞; 5：PK-15陰性細(xì)胞圖5　PCR檢測(cè)傳代10代病毒DNA***

2.4　病毒Cap蛋白基因轉(zhuǎn)錄檢測(cè)

提取盲傳10代的重組細(xì)胞病毒液中總RNA后，經(jīng)DNase Ⅰ處理，RT-PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)條帶大小約486 bp，表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Cap基因mRNA存在特異性剪接和表達(dá)(圖6)。

M：DNA Marker；1：陰性對(duì)照；2：未經(jīng)DNase Ι處理PCV2 RNA；3：PCV2 DNA；4：DNase Ι處理的PCV2 RNA；5：PK-15陰性細(xì)胞RNA圖6　重組病毒Cap RNA檢測(cè)

2.4　間接免疫熒光檢測(cè)

重組病毒感染爬片細(xì)胞后48 h利用IFA檢測(cè)PCV2 ORF2表達(dá)，結(jié)果如圖7所示，重組PCV2感染細(xì)胞用抗PCV2 ORF2抗體為一抗在熒光顯微鏡下檢測(cè)到特異性綠色熒光，而陰性對(duì)照細(xì)胞無特異熒光產(chǎn)生，因此自環(huán)病毒在體外轉(zhuǎn)染后再感染細(xì)胞可以產(chǎn)生具感染性的子代PCV2病毒。

圖7　重組病毒感染PK-15細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)

3　討　論

越來越多的研究表明，PCV2通常以混合感染的方式引起豬只PMWS，因此由PCV2混合感染病料直接接種細(xì)胞難以獲得純的PCV2病毒，給PCV2相關(guān)研究增加難度[20-22]。Meerts等[23]發(fā)現(xiàn)，PCV2在接種后6～12 h的PK-15細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到Cap蛋白表達(dá)，接種后12～24 h的Cap主要分布在細(xì)胞核周圍，并有子代病毒產(chǎn)生。通過細(xì)胞連續(xù)傳代表明PCV2增殖能力較強(qiáng)，因而利用病毒的感染性DNA克隆，獲得遺傳背景單純的拯救病毒，是PCV2致病機(jī)理、相關(guān)疾病防治和疫苗開發(fā)研究的有力工具。

國內(nèi)外已有應(yīng)用PCV2全基因組復(fù)制出完整病毒的報(bào)道。Liu等[24]構(gòu)建含有 PCV2全基因組的重組質(zhì)粒，體外環(huán)化轉(zhuǎn)染豬視網(wǎng)膜細(xì)胞系得到具有感染性的病毒，應(yīng)用構(gòu)建的感染性病毒在進(jìn)行致病性實(shí)驗(yàn)時(shí)可避免其它病毒的干擾，容易定量和在細(xì)胞傳代過程中不易產(chǎn)生變異等優(yōu)點(diǎn)。Fenaux等[25]和郗鑫等[26]用酶切位點(diǎn)SacⅡ構(gòu)建PCV2體外感染性分子克隆，但采用體外自環(huán)的方式將PCV2全基因環(huán)化再轉(zhuǎn)染PCV陰性PK15細(xì)胞，在其子代細(xì)胞中檢測(cè)到病毒相應(yīng)的抗原，而Fenaux將線性化的兩條單拷貝PCV2同向連接在一起，利用酶切位點(diǎn)SacⅡ與pBluescript SK載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，再感染以獲得成熟病毒粒子，同時(shí)發(fā)現(xiàn)雙拷貝比單拷貝體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率高。本研究利用高拷貝的質(zhì)粒載體pMD18-T正向插入單拷貝的PCV2全基因，兩端引物含XbaⅠ序列重疊，經(jīng)自環(huán)化顯示構(gòu)建的自環(huán)化質(zhì)粒ds-PCV2具有感染性，但與李俊等[27]研究結(jié)果不同，重組質(zhì)粒pSK-PCV2轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞沒有檢測(cè)到子代病毒，推測(cè)與PCV2的滾環(huán)復(fù)制機(jī)制和共價(jià)閉合環(huán)狀DNA基因組有關(guān)[28-29]。連到pBluescript SK載體上的PCV2全基因組DNA分子因載體序列的分隔使PCV2全基因組不連續(xù)，因而失去部分重要功能。另一種可能原因是由于重組質(zhì)粒pSK-PCV2轉(zhuǎn)染產(chǎn)生子代病毒但在PK-15細(xì)胞中的增殖滴度不高，基因組轉(zhuǎn)染效率較差，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染后細(xì)胞PCR檢測(cè)呈陰性。

4　結(jié)　論

本文通過PCR成功擴(kuò)增出PCV2 1767bp全基因組，利用設(shè)計(jì)的一對(duì)含XbaⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物成功構(gòu)建PMD-PCV2重組質(zhì)粒。將質(zhì)粒體外酶切自環(huán)化后轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞并檢測(cè)到PCV2病毒的復(fù)制，結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建PCV2全長DNA克隆和拯救病毒。經(jīng)過測(cè)序的PCV2-SY株系為PCV2b亞型，與國內(nèi)外毒株有著極高的同源性，介于95.4%～99.9%之間，具有很強(qiáng)的代表性，為后續(xù)研究PCV2病毒致病機(jī)理、疫苗開發(fā)和有效治療奠定基礎(chǔ)。