羅亞玲，李　冰，吳　強(qiáng)

(1.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院，四川 成都　611731；2.樂山市中醫(yī)醫(yī)院，四川 樂山　614000)

0　引　言

1　材料與儀器

1.1　材　料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：抗骨增生丸(大蜜丸，每丸重3 g，批號(hào)，20150402)，由吉林龍?zhí)┲扑幑煞萦邢薰旧a(chǎn)；淫羊藿對(duì)照品(批號(hào)，110737-201516，含量94.2%)，柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)，110722-201613，含量94.3%)，均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純.

1.2　儀　器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：Agilent 1200型高效液相色譜儀(安捷倫公司)，LC-20A型高效液相色譜儀(島津公司)；CPA-225型電子天平(賽多利斯公司).

2　方法與結(jié)果

2.1　色譜條件

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為：色譜柱為Thermo Syncronis C18(250×4.6 mm，5 μm)；波長參考《藥典》各藥材項(xiàng)下含量測定波長，將淫羊藿苷的檢測波長定為270 nm，柚皮苷的檢測波長定為282 nm；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，并按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min；理論板數(shù)分別按柚皮苷峰和淫羊藿苷峰計(jì)算，均應(yīng)不低于5 000.

表1　梯度洗脫程序表

2.2　對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取柚皮苷對(duì)照品12.53 mg、淫羊藿苷對(duì)照品11.41 mg，置50 mL量瓶中，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為柚皮苷貯備溶液與淫羊藿苷貯備溶液.精密吸取柚皮苷貯備溶液1 mL與淫羊藿苷貯備溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得每1 mL含柚皮苷0.02363 mg與淫羊藿苷0.02150 mg的混合對(duì)照品溶液.

2.3　供試品溶液制備

取抗骨增生丸(大蜜丸)，研碎，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，90 ℃加熱回流45 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，制得供試品溶液.

2.4　專屬性實(shí)驗(yàn)

取抗骨增生丸以及缺骨碎補(bǔ)的陰性對(duì)照樣品和缺淫羊藿的陰性對(duì)照樣品按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液及陰性供試品溶液并進(jìn)樣分析.結(jié)果顯示：陰性供試品在柚皮苷峰與淫羊藿苷峰位置處無相應(yīng)的峰出現(xiàn)(見圖1)，表明陰性無干擾，專屬性強(qiáng).

2.5　精密度實(shí)驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得柚皮苷和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.07%和0.16%(n=6).結(jié)果表明，2種對(duì)照品溶液的RSD均小于1.0%，表明儀器的精密度良好.

2.6　穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱定供試品溶液5 μL在0、2、6、12、24 h時(shí)進(jìn)樣測定，計(jì)算得柚皮苷和淫羊藿甘峰面積的RSD分別為0.21%和0.23%(n=5)，均小于1.0%.結(jié)果表明,供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.7　重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取抗骨增生丸樣品6份，分別制備供試品溶液并進(jìn)樣測定，計(jì)算柚皮苷和淫羊藿苷的含量分別為0.5573 mg/g和0.5219 mg/g，RSD分別為0.39%和1.6%(n=6).樣品重復(fù)測定6次結(jié)果的RSD小于2.0%,表明本方法的重復(fù)性良好.

2.8　線性范圍考察

按照“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液的制備的方法，將柚皮苷與淫羊藿苷對(duì)照品溶液精密稀釋成系列濃度，注入液相色譜儀測定.以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸.測定結(jié)果見表2、3與圖2、3.

表2　柚皮苷線性范圍測定結(jié)果

表3　淫羊藿苷線性范圍測定結(jié)果

結(jié)果表明：柚皮苷的線性方程為，Y=1696X-117.6(r=1.0000,n=6)，進(jìn)樣量在2.9539～236.3158 ng的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；淫羊藿苷的線性方程為:Y=2065X+458.3(r=1，n=6)，進(jìn)樣量在2.6871～214.9644 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

(a)抗骨增生丸樣品液相色譜圖

(b)柚皮苷對(duì)照品液相色譜圖

(c)缺骨碎補(bǔ)陰性樣品液相色譜圖

(d)淫羊藿苷對(duì)照品液相色譜圖

(e)缺淫羊藿陰性樣品液相色譜圖

圖1樣品液相色譜圖

圖2柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.9　回收率

取6個(gè)具塞錐形瓶，分別精密加入柚皮苷與淫羊藿苷對(duì)照品貯備溶液(柚皮苷濃度為0.2363 mg/mL、淫羊藿苷濃度為0.2150 mg/mL)各1 mL，蒸干溶液；取6份已知含量的抗骨增生丸樣品(批號(hào)，101，柚皮苷含量為0.5573 mg/g、淫羊藿苷含量為0.5219 mg/g)約0.5 g，精密稱定，置上述錐形瓶中，分別制備供試品溶液并進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4、表5.

表4　柚皮苷加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5　淫羊藿苷加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：柚皮苷與淫羊藿苷加樣回收率分別為96.90%和99.71%，其RSD分別為1.52%和1.80%.結(jié)果表明，本方法回收率良好.

2.10　耐用性考察

取抗骨增生丸樣品進(jìn)行耐用性考察，實(shí)驗(yàn)采用不同色譜柱為：Welch Ultimate C18(250×4.6mm，5 μm)，Kromasil C18(250×4.6 mm，5 μm)，Thermo Syncronis C18(250×4.6 mm，5 μm).實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，待測色譜峰與雜質(zhì)峰均能分開(見表6).

表6　耐用性考察結(jié)果

耐用性考察結(jié)果表明：RSD均小于1.0%，表明本方法耐用性良好.

3　結(jié)　語

本研究采用《中國藥典》2015版抗骨增生丸淫羊藿含量測定項(xiàng)下的色譜條件，樣品中柚皮苷色譜峰與其他組分色譜峰不能較好分離.經(jīng)過進(jìn)一步對(duì)比研究,最終選擇乙腈—水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用該流動(dòng)相配比簡單，出峰時(shí)間短，峰形好，理論塔板數(shù)高，分離效果好.另外，本研究分別考察了50%甲醇和80%甲醇作為提取溶劑，采用超聲提取和加熱回流2種提取方式，提取30、45、60 min，2種成分均以50%甲醇回流45 min提取的效率較高.同時(shí)，采用本研究確定的方法，并參照抗骨增生丸處方及服用量，以平均含量的70%折算，暫定含量限度為：本品含骨碎補(bǔ)以柚皮苷計(jì)，水蜜丸每1 g不得少于0.08 mg/g；小蜜丸每1 g不得少于0.06 mg/g；大蜜丸每丸不得少于0.18 mg/丸.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法簡便，穩(wěn)定、重復(fù)性好，能準(zhǔn)確地對(duì)抗骨增生丸中柚皮苷和淫羊藿苷同時(shí)進(jìn)行測定，可為抗骨增生丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步完善提供參考.