聶忠莉，楊　慧，王曉玲，黃金玉，張　勇，蕭茂玲

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都　610106；2.成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司，四川 成都　610041)

0　引　言

阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片，是由阿莫西林三水合物和克拉維酸鉀組成的復(fù)方制劑，阿莫西林為殺菌性廣譜抗生素，克拉維酸鉀為不可逆的廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，其可有效抑制耐藥菌產(chǎn)生，使已對(duì)阿莫西林耐藥并產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌仍然對(duì)阿莫西林敏感[1].阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片臨床上用于因β-內(nèi)酰胺酶流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌所致的下呼吸道感染、中耳炎、鼻竇炎的治療，以及產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶金葡菌和產(chǎn)酶腸桿菌科細(xì)菌如大腸埃希菌、克雷伯菌屬所致的尿路和皮膚軟組織抗感染等[2].目前，阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，對(duì)此，本研究為了更好地控制其質(zhì)量，參照阿莫西林克拉維酸鉀片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3]中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，利用高效液相色譜法迅速、準(zhǔn)確、靈敏度高與專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)[4-5]對(duì)阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)量.

1　材料與儀器

1.1　材　料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片(批號(hào)，161001、161002、161003)，由四川制藥制劑有限公司生產(chǎn)；雜質(zhì)D(批號(hào)，56293，純度≥92.3%)、雜質(zhì)J(批號(hào)，R064U0，混合物)、雜質(zhì)C(批號(hào)，39563，純度≥96.3%)，由LGC公司生產(chǎn)；阿莫西林對(duì)照品(批號(hào)，130409-201512，純度≥86.9%)、克拉維酸對(duì)照品(批號(hào)，130409-201307，純度≥95.0%)、阿莫西林克位維酸系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)對(duì)照品(批號(hào)，130588-201202)，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純、磷酸二氫鉀為分析純，由成都科龍化工試劑廠生產(chǎn).

1.2　儀　器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：5410/L-2455型高效液相色譜儀(Hitachi公司)；BP-210D型電子天平(Sartorius公司)，pHS-3C型酸度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司).

2　方法與結(jié)果

2.1　色譜條件

實(shí)驗(yàn)色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相A為0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0)，流動(dòng)相B為0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0)—乙腈(20∶80)，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；先以流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(98∶2)等度洗脫，待阿莫西林洗脫完畢后立即按表1流程進(jìn)行線性梯度洗脫.

表1　梯度洗脫程序表

2.2　溶液配制

2.2.1供試品溶液配制.

取本品的細(xì)粉適量，加流動(dòng)相A溶解(必要時(shí)冰浴超聲5～10 min助溶)并稀釋制成每1 mL中含阿莫西林(按C16H19N3O5S計(jì))2 mg的溶液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.

2.2.2對(duì)照溶液配制.

精密量取供試液適量，用流動(dòng)相A定量稀釋制成每1 mL中含阿莫西林(按C16H19N3O5S計(jì))40 μg的溶液，作為對(duì)照溶液.

2.3　系統(tǒng)適用性及雜質(zhì)定位

精密稱取阿莫西林克拉維酸系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)對(duì)照品，加入流動(dòng)相A溶解并稀釋制成每1 mL中約含阿莫西林2.5 mg的溶液，作為系統(tǒng)適用性對(duì)照品溶液，取20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次.結(jié)果見(jiàn)表2、3及圖1、2.

表2　阿莫西林克拉維酸系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)峰面積結(jié)果

表3　阿莫西林克拉維酸系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)峰保留時(shí)間結(jié)果(min)

精密稱取雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)J對(duì)照品適量，分別加入流動(dòng)相A溶解并稀釋制成每1 mL含上述雜質(zhì)1 mg的儲(chǔ)備液.精密量取儲(chǔ)備液適量，分別加流動(dòng)相A稀釋制成每1 mL含上述雜質(zhì)0.1 mg的定位溶液，各取20 μL注入液相色譜儀，結(jié)果見(jiàn)表4.

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，記錄的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致，且阿莫西林、克拉維酸及各雜質(zhì)主峰峰面積的RSD%小于2.0%、保留時(shí)間RSD%小于1.0%，定位溶液的主峰與系統(tǒng)圖譜中相應(yīng)雜質(zhì)峰的保留時(shí)間一致.結(jié)果表明，該色譜條件下的系統(tǒng)適用性良好.

圖1阿莫西林克拉維酸制劑有關(guān)物質(zhì)用標(biāo)準(zhǔn)譜圖

圖2阿莫西林克拉維酸系統(tǒng)適用性對(duì)照品溶液圖譜

表4　定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4　專屬性實(shí)驗(yàn)

取本品(批號(hào)，161001)10片，精密稱定，研細(xì)，分別精密稱取細(xì)粉適量，再進(jìn)行強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、高溫和光照破壞性實(shí)驗(yàn).分別精密量取上述溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表5及圖3.

表5　阿莫西林克拉維酸有關(guān)物質(zhì)專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表5和圖3可知：空白溶劑和空白輔料無(wú)干擾；在各破壞條件下，阿莫西林峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1.5，克拉維酸峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度雖小于1.5，但與阿莫西林克拉維酸鉀系統(tǒng)適用性圖譜一致；降解平衡在90%～100%之間.因此，在本條件下系統(tǒng)專屬性良好.

圖3未破壞樣品HPLC圖譜

2.5　檢測(cè)限與定量限確定

取阿莫西林、克拉維酸鉀、雜質(zhì)C與雜質(zhì)D對(duì)照品適量，加入流動(dòng)相A溶解并稀釋制成每1 mL含阿莫西林2 mg、克拉維酸鉀0.3 mg、雜質(zhì)C 0.1 mg、雜質(zhì)D 0.1 mg的儲(chǔ)備液.精密量取各儲(chǔ)備液適量，加流動(dòng)相A稀釋制成一定濃度的溶液，取此溶液20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算信噪比，以信噪比約3∶1為檢測(cè)限，以信噪比約10∶1為定量限.檢測(cè)結(jié)果為：阿莫西林、克拉維酸鉀、雜質(zhì)C與雜質(zhì)D檢測(cè)限分別是0.06 μg、0.012 μg、0.06 μg與0.013 μg；定量限分別是0.55 μg、0.04 μg、0.551 μg與0.062 μg.

2.6　線性范圍考察

取“2.5”項(xiàng)下阿莫西林、克拉維酸鉀、雜質(zhì)C與雜質(zhì)D儲(chǔ)備液適量，置同一量瓶中分別用流動(dòng)相A稀釋至適宜的濃度，作為線性供試品溶液，分別精密量取各線性溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖.以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線.結(jié)果顯示：阿莫西林雜質(zhì)C在濃度為0.11～105.74 μg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣20 μL，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程式為，Y=39.335x+4.4896，R2=0.9999；阿莫西林雜質(zhì)D在濃度為0.10～97.38 μg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣20 μL，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程式為，Y=30.0364x+5.9779，R2=0.9999；阿莫西林在濃度為0.11～105.15 μg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣20 μL，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程式為，Y=30.0343x+4.8544，R2=0.9999；克拉維酸在濃度為0.10～101.94 μg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣20 μL，其峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程式為，Y=23.5674x+5.0952，R2=0.9999.

2.7　準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

精密稱取研細(xì)后的本品細(xì)粉各65.7 mg，共10份，置于10 mL量瓶中.1～3號(hào)精密加入雜質(zhì)儲(chǔ)備液(含雜質(zhì)C 0.1 mg/mL、雜質(zhì)D 0.2 mg/ml)0.5 mL，作為50%的供試品樣；4～6號(hào)精密加入雜質(zhì)儲(chǔ)備液(含雜質(zhì)C 0.1 mg/mL、雜質(zhì)D 0.2 mg/mL)1 mL，作為100%的供試品樣；7～9號(hào)精密加入雜質(zhì)儲(chǔ)備液(含雜質(zhì)C 0.1 mg/mL、雜質(zhì)D 0.2 mg/mL)1.5 mL，作為150%的供試品樣；10號(hào)作為未加雜質(zhì)的供試品樣.分別向1～10號(hào)加流動(dòng)相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動(dòng)相A至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.

取雜質(zhì)儲(chǔ)備液適量，加入流動(dòng)相A稀釋制成每1 mL中約含雜質(zhì)C 0.01 mg、雜質(zhì)D 0.02 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；另精密量取各供試品溶液1 mL，置于50 mL量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液.

取上述對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀分別測(cè)定.分別按外標(biāo)法、自身對(duì)照法計(jì)算各雜質(zhì)含量.結(jié)果顯示：采用自身對(duì)照法測(cè)定咀嚼片中阿莫西林雜質(zhì)C的平均回收率為121.28%，RSD為2.9%，雜質(zhì)D的平均回收率為94.98%，RSD為4.3%，回收率不符合要求；采用外標(biāo)法測(cè)定咀嚼片中阿莫西林雜質(zhì)C的平均回收率為98.72%，RSD為2.4%，雜質(zhì)D的平均回收率為96.98%，RSD為2.4%，各雜質(zhì)的回收率均在90%～100%之間，RSD小于5.0%，回收率良好，準(zhǔn)確度符合要求.

從兩種方法測(cè)定的雜質(zhì)含量的數(shù)據(jù)可看出，自身對(duì)照法測(cè)定的雜質(zhì)含量值均大于或相當(dāng)于外標(biāo)法測(cè)定的雜質(zhì)含量值.因此，采用自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量，仍能很好地控制本品中的雜質(zhì)限度，其方法是可行的.

2.8　精密度實(shí)驗(yàn)

2.8.1重復(fù)性實(shí)驗(yàn).

精密稱取研細(xì)后的本品細(xì)粉各65 mg共6份，分別加流動(dòng)相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動(dòng)相A至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.另精密量取供試液1 mL，置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液.

取上述對(duì)照溶液和供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀分別測(cè)定，分別按自身對(duì)照法計(jì)算各雜質(zhì)含量，6份樣品測(cè)定含量基本一致，RSD%均小于10.0，說(shuō)明重復(fù)性良好.

2.8.2進(jìn)樣精密度實(shí)驗(yàn).

精密稱取研細(xì)后的本品細(xì)粉66.66 mg，加流動(dòng)相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動(dòng)相A至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.精密量取供試液1 mL，置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液.

取上述對(duì)照溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，對(duì)照溶液6次連續(xù)進(jìn)樣各成分峰面積RSD%均小于1.0，說(shuō)明進(jìn)樣精密度良好.

2.8.3中間精密度實(shí)驗(yàn).

由不同分析人員在不同時(shí)間、不同儀器上取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下細(xì)粉6份，同法測(cè)定.結(jié)果顯示，同一樣品由不同人員在不同時(shí)間、不同儀器上重復(fù)測(cè)定12次，RSD%的含量均小于20.0，說(shuō)明中間精密度良好.

2.9　穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱取研細(xì)后的本品細(xì)粉64.17 mg，加流動(dòng)相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動(dòng)相A至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.精密量取供試液1 mL，置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液.分別在0、2、4、6、8 h取供試品溶液及對(duì)照溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按自身對(duì)照法計(jì)算各雜質(zhì)含量.結(jié)果顯示：同一樣品，對(duì)照溶液分別在0、2、4、6、8 h內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣，各雜質(zhì)和主峰面積均無(wú)明顯變化，峰面積RSD均小于1.0%，對(duì)照溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定；供試品溶液雜質(zhì)含量隨時(shí)間推移在不斷增加，但在2 h內(nèi)變化較小，8 h內(nèi)雖然增加，但在仍標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍內(nèi).因此，對(duì)本品有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定最好在樣品配制2 h內(nèi)進(jìn)樣.

2.10　耐用性實(shí)驗(yàn)

精密稱取研細(xì)后的本品細(xì)粉66.11 mg，加流動(dòng)相A至8 mL，冰浴超聲提取10 min，取出，放至室溫，加流動(dòng)相A至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.精密量取供試液1 mL，置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液.

取上述供試品和對(duì)照溶液和空白溶劑，按表6相關(guān)數(shù)據(jù)改變流動(dòng)相流速、pH值與不同色譜柱等因素來(lái)考察變動(dòng)因素對(duì)含量測(cè)定的影響，結(jié)果如表6所示.

表6　阿莫西林有關(guān)物質(zhì)耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(%)

表6數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)在流動(dòng)相流速與pH值發(fā)生微小變化，以及更換不同品牌的色譜柱的情況下，測(cè)定樣品中各雜質(zhì)含量以及各成分峰之間的分離度與原條件變化不大.此表明本方法的耐用性良好.

2.11　樣品中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

按驗(yàn)證后符合要求的方法，分別對(duì)3批樣品進(jìn)行了檢測(cè)，并分別以對(duì)照溶液中的2個(gè)主峰面積和以及阿莫西林峰計(jì)算各雜質(zhì)的含量，結(jié)果如表7、8所示.

表7　3批樣品有關(guān)物質(zhì)各雜質(zhì)含量(%)測(cè)定結(jié)果

表8　3批樣品有關(guān)物質(zhì)各雜質(zhì)含量(%)測(cè)定結(jié)果

表7、8數(shù)據(jù)表明，阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果3批樣品均符合規(guī)定.

3　結(jié)　論

本研究通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定阿莫西林克拉維酸鉀咀嚼片中的有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明：采用自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量，能很好地控制本品中的雜質(zhì)限度，即采用自身對(duì)照法測(cè)定本品雜質(zhì)含量的方法是可行的.