劉　濤，徐騰達，梁　悅，張　倩，鄧燕君，彭曉鳳，徐玉玲

(成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都　610106)

0　引　言

麥冬為百合科沿階草屬植物麥冬的肉質(zhì)塊莖，具有養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除煩等功效.臨床常用于治療冠心病、心絞痛等癥[1-2].目前，麥冬藥材常用于中藥注射劑中，如麥冬注射液、參麥注射液、紅參麥冬復方注射液等[3-5].相關研究與報道顯示，麥冬的主要成分之一為甾體皂苷，而皂苷類成分一般具有溶血作用，因此，該類中藥注射液的主要不良反應為產(chǎn)生溶血現(xiàn)象[6-8].對此，本研究通過制備不同純度的麥冬皂苷樣品，在一定質(zhì)量濃度梯度下進行體外溶血實驗，探討麥冬皂苷的溶血作用，擬為保證相關藥物的臨床應用安全提供依據(jù).

1　材料與儀器

1.1　材　料

1.1.1材料.

實驗所用材料包括：麥冬(產(chǎn)地四川，批號，20170621)，購自成都荷花池藥材批發(fā)市場，經(jīng)檢驗為百合科沿階草屬植物麥冬的肉質(zhì)塊莖；新西蘭大白兔，雄性，體質(zhì)量2 Kg，普通級，購自成都達碩試驗動物有限公司(合格證號，SCXK(川)2013-17).實驗中對動物的處理遵循相關動物使用的倫理學原則.

1.1.2試劑.

實驗所用試劑包括：魯斯可皂苷元對照品(批號，151220，純度≥98%)，購自四川維克奇生物科技有限公司；生理鹽水(0.9%氯化鈉注射液，批號，B15042001)，購自四川科倫藥業(yè)公司；正丁醇(批號，20160121)、高氯酸(批號，20151021)、95%乙醇(批號，20151002)，均購自成都科龍化工試劑廠；試劑均為分析純，水為怡寶純凈水.

1.2　儀　器

實驗所用儀器包括：TU-1810型紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限責任公司)，F(xiàn)A-2004型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)，TD-5型離心機(長沙英泰儀器有限公司)，DH-3600A型電熱恒溫培養(yǎng)箱(西安禾普生物科技有限公司)，RE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(成都康宇科技有限公司)，DZF-6050型真空干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司).

2　方法與結(jié)果

2.1　不同純度麥冬供試品溶液的制備

2.1.1麥冬皂苷A溶液的制備.

取500 g麥冬，加4 000 mL 60 %乙醇，提取3次，每次1.5 h.過濾提取液，80 ℃減壓濃縮，醇沉(醇沉濃度為80%)，靜置24 h，過濾，于80 ℃下，減壓濃縮與減壓干燥，得麥冬皂苷浸膏A.取適量浸膏A加生理鹽水，超聲1 min，配制成麥冬皂苷A儲備溶液，其皂苷純度為4.0%.取適量該儲備液，加生理鹽水分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mg/mL的溶液作為麥冬皂苷A溶液的供試品溶液.

2.1.2麥冬皂苷B溶液的制備.

取“2.1.1”項下麥冬皂苷浸膏A適量，加純凈水溶解，過AB-8型大孔樹脂純化.然后，用純凈水和70%乙醇分別洗脫，分別接收洗脫液，并于80 ℃下，分別減壓濃縮與減壓干燥，得麥冬皂苷浸膏B和分離物浸膏.取適量浸膏B加生理鹽水，超聲1 min，配制成麥冬皂苷B儲備液，其皂苷純度為17.2%.取適量該儲備液加生理鹽水分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.03，0.06，0.12，0.18，0.24，0.30 mg/mL的溶液作為麥冬皂苷B溶液的供試品溶液.同時，分離物浸膏按照與浸膏B純化時的比例進行稀釋配制，作為分離物供試品溶液.

2.1.3麥冬皂苷C溶液的配制.

取“2.1.2”項下麥冬皂苷浸膏B適量，加純凈水超聲1 min溶解，加等量水飽和正丁醇萃取4次，收集萃取液和萃余液，于80 ℃下，減壓濃縮與減壓干燥，得麥冬皂苷浸膏C和萃余液浸膏.取適量浸膏C加生理鹽水，超聲1 min，配制成麥冬皂苷C儲備液，其皂苷純度為73.8%.取適量該儲備液加生理鹽水分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.03，0.06，0.12，0.18，0.24，0.30 mg/mL的溶液作為麥冬皂苷C溶液的供試品溶液.同時，萃余液浸膏按照與浸膏C萃取時的比例進行稀釋配制，作為萃余液供試品溶液.

2.2　2%紅細胞混懸液的配制[9]

從家兔耳緣靜脈取新鮮血液10 mL，置燒杯中，用纏有少量脫脂棉的玻璃棒輕輕攪拌約10 min，取出血液中的纖維蛋白，制成脫纖血液，加入約10倍量生理鹽水，搖勻，3 000 r/min離心10 min，棄去上清液.按此方法重復4～5次，洗至上清液呈無色透明.將所得紅細胞用生理鹽水配制成壓積為2%的紅細胞混懸液，置4 ℃冰箱中保存，備用.

2.3　溶血率測定條件選擇

2.3.1吸收波長選擇.

《中國藥典》2015版第四部中規(guī)定的溶血率測定方法中僅能定性鑒別藥物的溶血性，而不能定量測定藥物溶血率的大小.對此，本研究通過篩選，選定利用紫外分光光度法測定體外紅細胞的溶血率[10]，其最大吸收波長為關鍵參數(shù)，確定步驟為：以生理鹽水2 mL中加入兔紅細胞混懸液2 mL為陰性對照組，以純凈水2 mL中加入兔紅細胞混懸液2 mL為陽性對照組；取“2.1”項下麥冬皂苷A供試品溶液4 mL為樣品組.取各組溶液，搖勻，置于(37±0.5)℃保溫培養(yǎng)箱中保溫3 h，取出于3 000 r/min離心10 min，取上清液至比色皿中.以陰性組為空白，對陽性對照組和樣品組于波長200～700 nm進行光譜掃描.結(jié)果顯示，其最大吸收波長為540 nm，且樣品組在該波長下無干擾吸收.故選擇540 nm波長為溶血率的測定波長.

2.3.2保溫時間選擇.

按“2.3.1”項下方法制備陰性和陽性對照組，將“2.1”項下麥冬皂苷A供試品溶液2 mL中加入兔紅細胞混懸液2 mL為樣品組.取各組溶液輕輕振搖，混合均勻，置于(37±0.5)℃保溫培養(yǎng)箱中保溫0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，取出于3 000 r/min離心10 min，取上清液至比色皿中，在540 nm波長下測定吸光度.結(jié)果表明，在2.5～4.0 h范圍內(nèi)，紅細胞溶血趨于穩(wěn)定.故選擇保溫時間為3 h.

2.3.3重復性考察.

按“2.3.1”項下方法制備陰性和陽性對照組，將“2.1”項下麥冬皂苷A供試品溶液2 mL中加入兔紅細胞混懸液2 mL為樣品組.配制6組，將各組溶液輕輕振搖，混合均勻，置于(37±0.5)℃保溫培養(yǎng)箱中保溫3.0 h，取出于3 000 r/min離心10 min，取上清液至比色皿中，在540 nm波長下測定吸光度，結(jié)果見表1.

表1　吸光度重復性測試

2.3.4溶血率測定.

溶血率的測定采用紫外分光光度法，其步驟為：以生理鹽水2 mL中加入兔紅細胞混懸液2 mL為陰性對照組，以純凈水2 mL中加入兔紅細胞混懸液2 mL為陽性對照組，按“2.1”項下方法制備的供試品按相應要求進行加樣配制為樣品組.取各組溶液輕輕振搖，混合均勻，置于(37±0.5)℃保溫培養(yǎng)箱中保溫3 h，取出于3 000 r/min離心10 min，取上清液至比色皿中.以陰性組為空白，采用比色法于波長540 nm下分別測定陽性組的吸光度(A陽)和樣品組的吸光度(A樣)，并按，溶血率=A樣/A陽×100%，計算溶血率，同時繪制各樣品的溶血率—質(zhì)量濃度曲線.

2.4　溶血濃度考察

按“2.3”項下方法制備陰性和陽性對照組，將“2.1”項下各麥冬皂苷供試品溶液2 mL中加入兔紅細胞混懸液2 mL為樣品組.取各組溶液輕輕振搖，混合均勻，置于(37±0.5)℃保溫培養(yǎng)箱中保溫3.0 h，取出于3 000 r/min離心10 min，取上清液至比色皿中.在540 nm波長下測定吸光度.計算溶血率.結(jié)果見圖1、表2.

圖1麥冬皂苷溶血率—質(zhì)量濃度曲線

表2　麥冬皂苷溶血濃度

溶血作用的判斷方法參考文獻[11]中的相關判斷依據(jù)，即：體外紅細胞的溶血率>5%表示有溶血作用；溶血率≤5%表示沒有溶血作用.由圖1及表1可知：當皂苷純度為4%時，質(zhì)量濃度為0.06 mg/mL時，未出現(xiàn)溶血，當質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL時，溶血率上升至13%；當皂苷純度為17%時，質(zhì)量濃度為0.06 mg/mL時，未出現(xiàn)溶血，當質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL時，溶血率上升至15%；當麥冬皂苷純度為73%時，質(zhì)量濃度為0.03 mg/mL時，未發(fā)生溶血，當質(zhì)量濃度為0.06 mg/mL時，溶血率上升至12.5%.據(jù)此可知，麥冬皂苷具有體外溶血作用，且麥冬皂苷純度越高，其溶血率越大.

2.5　不同純化方法對皂苷溶血作用的影響

取大孔樹脂及萃取純化后所得到的麥冬皂苷及其相應的“雜質(zhì)”溶液，按照按表3配制溶液.

表3　溶血還原溶液

將各組溶液輕輕振搖，混合均勻，置于(37±0.5)℃保溫培養(yǎng)箱中保溫3.0 h，取出于3 000 r/min離心10 min，取上清液至比色皿中.在540 nm波長下測定吸光度，計算溶血率，結(jié)果見表4.

表4　不同純化方法對皂苷溶血作用的影響

由表4中1#，2#，3#數(shù)據(jù)得出：大孔樹脂純化后的“雜質(zhì)”與皂苷B溶液按照純化前的比例進行混合還原后所得溶液的溶血率比皂苷A和皂苷B溶液的溶血率高，由2#，4#，5#數(shù)據(jù)得出正丁醇萃取后的萃余液和萃取液混合還原后的溶血率比皂苷B高，但和皂苷C溶液的溶血率大致相同.

3　結(jié)果與討論

3.1　結(jié)　果

本研究通過配制不同純度與不同濃度的麥冬皂苷溶液進行體外溶血研究，采用紫外分光光度法測定溶血率.實驗結(jié)果表明，麥冬皂苷具有體外溶血作用，其溶血率隨皂苷濃度升高而增大，且麥冬皂苷純度越高，其溶血率越大.對不同純化方式所得到的“雜質(zhì)”與皂苷類成分按比例混合“還原”后的溶血實驗表明，采用正丁醇萃取的純化方式還原后，萃取前后的溶血作用基本不變，而采用大孔樹脂純化后的兩部分物質(zhì)混合“還原”后溶血作用高于純化前的溶血作用.

3.2　討　論

中藥具有成分復雜與作用機理尚不明確的特點，隨著中藥注射液臨床應用越來越多，其安全性研究有待加強.目前，在中藥注射液的制法中，科研人員經(jīng)常將主要藥用成分進行分離純化，以減小藥物副作用和達到更好的藥用療效.本研究表明，麥冬皂苷純度越高，其相同濃度皂苷的溶血率越大.因此，在配制含有皂苷類成分的注射液時皂苷類成分是否越純越好，純度越高是否療效越好，這是在中成藥工藝研究過程中設計含皂苷類成分的藥材純化工藝時應重點考慮的問題.此外，據(jù)文獻報道,大孔樹脂的吸附純化為物理吸附，對藥物的化學結(jié)構(gòu)不會造成影響[12-13].而本實驗中通過大孔樹脂純化麥冬皂苷，得到的“雜質(zhì)”與皂苷類成分按比例混合“還原”后，其溶血作用發(fā)生了較大的改變，而通過正丁醇萃取純化麥冬皂苷，得到的“雜質(zhì)”與皂苷類成分按比例混合“還原”后，其溶血作用未發(fā)生明顯的變化，其原因有待進一步研究.