莊昆海 李海文 劉 洪 潘靜琳 劉鳳斌

慢性萎縮性胃炎 （chronic atrophic gastritis,CAG）伴有中、重度腸上皮化生和（或）異型增生與胃癌的發(fā)生有密切關(guān)系，CAG伴有腸上皮化生及異型增生是胃癌前病變，在胃黏膜癌前疾病中占有重要地位[1]。

長期慢性炎癥刺激可影響正常細胞的代謝和增殖，從而導(dǎo)致胃黏膜炎癥、異型增生和癌變過程。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB是腫瘤細胞內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、致癌作用以及抗放射的關(guān)鍵分子，也是趨化因子產(chǎn)生的核心轉(zhuǎn)錄因子[2-3]。NF-κB是多條信號通路的樞紐分子，調(diào)控一系列細胞因子的表達，炎性細胞因子又可進一步誘導(dǎo)NF-κB持續(xù)性活化。TNF-α是重要的炎性因子，TNF-α慢性刺激可促進腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移。TNF-α活化NF-κB，促進細胞增殖，由炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化。p50為NF-κB1，以p65/p50的二聚體形式存在，可促使NF-κB入核，激活基因轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

CAG屬于癌前疾病，研究炎癥通路中的關(guān)鍵因子在萎縮性胃炎癌變過程中的作用，有利于更好地明確CAG發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的機理，為臨床用藥和治療提供依據(jù)。

材料與方法

一、動物

選用70～80 d SPF級SD雄性大鼠94只，體重在170～200 g，由廣東省動物實驗中心提供（動物許可證號：SCXK[粵]2013-0002）。動物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，在室溫（22±2）℃，濕度55%±5%的環(huán)境中飼養(yǎng)，保持晝夜節(jié)律各12 h，自由飲食和喝水。

二、實驗藥物

1.胃萎清顆粒劑

藥物由北芪、白術(shù)、半枝蓮、莪術(shù)、五指毛桃、枳殼等組成。由廣東省一方制藥有限公司提供，并進行質(zhì)量控制（批號：J1603001），提供質(zhì)量合格證明。

2.葉酸片

由江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司提供（批準文號：國藥準字 H32023288，產(chǎn)品批號：1507026），規(guī)格為5 mg×100片/瓶。

3.N-甲基-N′-硝基-N′-亞硝基胍（MNNG）

由日本東京株氏會社提供，MNNG飲用液濃度為180μg/mL，裝入500 mL的避光飲水瓶中自由飲用，每2天更換一次。

三、動物分組及造模給藥

本研究購入94只70～80 d SPF級SD健康雄性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組和CAG模型組。其中空白對照組14只，CAG模型組80只?？瞻讓φ战M給予正常飲食、自由飲水，直至整個實驗結(jié)束。CAG模型組則予濃度為180μg/mL的MNNG飲用液自由飲用，并在此基礎(chǔ)上采用經(jīng)典的饑飽失常法復(fù)制脾虛證（即喂食1 d，而后禁食1 d，如此循環(huán)），連續(xù)造模直至第14周，隨機抽取模型組中的兩只CAG大鼠，進行胃黏膜病理組織學(xué)檢查，結(jié)果顯示兩只大鼠胃黏膜病理組織學(xué)為胃黏膜固有腺體萎縮伴腸上皮化生為造模成功。

確定造模成功后開始給藥，將CAG模型組隨機分為5組：模型組，胃萎清高劑量組，胃萎清中劑量組，胃萎清低劑量組及葉酸組。其中模型組14只，胃萎清高、中、低劑量組及葉酸組均分別為16只，正常對照組和模型對照組給予等量生理鹽水。胃萎清高、中、低劑量組于第15周開始灌胃，按照人的80 g/60 kg，平均1 333 mg/kg，大鼠給藥量為1 333 mg/kg×35/6=7 776 mg/kg，此為一倍劑量。因此，測算后胃萎清高、中、低劑量組給藥濃度（生藥量）分別為15.6 g/kg、7.8 g/kg、3.9 g/kg。 葉酸組第 15 周開始按1.46 mg·kg-1·d-1予葉酸灌胃。灌胃容積為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)灌胃10周。實驗過程中，每2周給各組大鼠測量一次體重，以觀察體重變化情況。

實驗結(jié)束后所有大鼠禁食不禁水24 h，用10%的水合氯酸（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，處死大鼠后，取全血，4℃2 000 rpm離心10 min，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆?。取全胃，沿大彎剪開胃壁，4℃生理鹽水清洗后，取胃竇部組織，10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片，用于相關(guān)指標的檢測，其余部分胃黏膜層（剔除肌肉層）組織立即置于-80℃低溫冰箱中保存，用于TNF-α、IKK、p50蛋白表達水平檢測。

四、指標檢測方法

1.RT-PCR法檢測胃黏膜組織p50的表達

Trizol試劑盒提取總RNA。取1μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物取20μL進行PCR反應(yīng)，同時以GADPH作為內(nèi)參，通過2-△△Ct法進行結(jié)果分析。

根據(jù)指標的條件在GenBank查詢，選取合適的上下游引物，進行PCR反應(yīng)。

p50引物設(shè)計見表1，內(nèi)參Beta actin引物設(shè)計見表2。

2.采用Western blot方法檢測TNF-α、IKK和p50蛋白表達水平

五、統(tǒng)計方法

選用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胃黏膜TNF-α蛋白表達

實驗各組胃黏膜TNF-α蛋白表達水平如表3所示。單因素方差分析結(jié)果表明，6組間TNF-α蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。組間兩兩比較結(jié)果顯示，模型組TNF-α蛋白表達水平明顯高于胃萎清高、中、低劑量組及空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。胃萎清高、中、低劑量組與葉酸組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

二、胃黏膜IKK蛋白表達

實驗各組IKK蛋白表達水平見表3。單因素方差分析結(jié)果表明，6組間IKK蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。組間兩兩比較結(jié)果顯示，模型組IKK蛋白表達水平顯著高于胃萎清高、中、低劑量組及空白組（P＜0.05）；胃萎清高、中、低劑量組與葉酸組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Western blot顯示，在胃萎清高、中劑量組IKK蛋白表達明顯減少，模型組的表達明顯增多；在胃萎清高、中劑量組TNF-α蛋白表達明顯減少，模型組的表達明顯增多（圖1）。

圖1 Western blot顯示p50、IKK、TNF-α蛋白在各組的表達

三、胃黏膜p50蛋白表達

胃萎清高劑量組的p50蛋白表達水平與模型組相比（P＜0.05），見表3。提示胃萎清高劑量組可能對p50蛋白表達水平有下調(diào)趨勢。

討 論

炎癥反應(yīng)是機體的主動防御機制，但長期慢性炎癥刺激卻是腫瘤發(fā)生發(fā)展的誘發(fā)因素之一。慢性非可控性炎癥參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程[4]，是癌癥的重要發(fā)病機制之一。當(dāng)機體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，免疫應(yīng)答細胞能夠釋放炎癥因子。這些因子不僅直接誘導(dǎo)正常細胞中的原癌和抑癌基因突變，使正常細胞發(fā)生癌變；同時它們還促進腫瘤細胞的增殖、抗凋亡、遷移、血管發(fā)生等，使癌癥進一步惡化。由炎癥到癌癥的發(fā)展過程中，有多條炎癥通路的激活，“炎-癌”鏈上，最基本的變化便是各種炎癥因子的激活與表達水平的改變。

表1 p50引物設(shè)計

表2 內(nèi)參Betaactin引物設(shè)計

表3 各組TNF-α、IKK、p50蛋白表達水平比較 （x±s）

目前，CAG被一致認為是一種癌前疾病，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IKK和p50在胃黏膜的萎縮、腸化生、異型增生甚至是癌變中起到關(guān)鍵作用，是CAG發(fā)展成胃癌的重要環(huán)節(jié)。我們的系列研究[5]結(jié)合病人所處嶺南地域特點和臨床特征，認為“濕、熱、風(fēng)、雨”為嶺南主要氣候特點，外邪侵襲，濕熱內(nèi)蘊，久之傷津耗氣，人多體虛，易感外邪，復(fù)虛實夾雜，故本病病因主要與“外邪侵襲、飲食傷胃、情緒失調(diào)、體虛久病”有關(guān)，基本病機是“脾虛氣滯，熱郁絡(luò)瘀”，并貫穿整個病程。課題組經(jīng)過長期臨床實踐發(fā)現(xiàn)健脾清熱活血法對CAG有一定的臨床療效，但其具體機制尚不明確。中藥對CAG的干預(yù)具有一定特色與優(yōu)勢，既往國內(nèi)相關(guān)臨床研究證實中醫(yī)藥可在一定程度上改善腺體萎縮、抑制腸上皮化生，但仍需更多嚴格設(shè)計的隨機雙盲對照試驗來驗證。本研究通過觀察CAG大鼠胃黏膜病理改變以及對 “炎-癌鏈”相關(guān)因子TNF-α、IKK及p50的變化，探討并試求揭示健脾清熱活血中藥對CAG的作用機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃萎清可在一定程度上抑制TNF-α的表達，對炎癥的發(fā)生起到一定的抑制作用。這是因為，TNF-α主要由細胞、單核吞噬細胞分泌。TNF-α除了具有直接溶解腫瘤細胞活性外，亦是具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子，能誘導(dǎo)MHC抗原表達，刺激單核細胞、巨噬細胞前體細胞分化，活化多形核白細胞，具有抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)，誘導(dǎo)IL-1、IL-6、IL-8等細胞因子的合成與分泌。眾多的研究顯示[6-7]，TNF-α參與了部分胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。在動物實驗中，腫瘤誘導(dǎo)劑TPA等可誘導(dǎo)多個器官出現(xiàn)TNF-α基因表達增加[8]。有研究表明[9]，TNF-α可以增強胃黏膜血管的通透性與上皮細胞的反應(yīng)性，促使血管出血、壞死，導(dǎo)致胃黏膜血供欠佳，不利于胃黏膜損傷的修復(fù)，從而加劇了胃黏膜的炎癥發(fā)生和發(fā)展，造成胃黏膜損傷加重。而胃萎清通過抑制TNF-α的表達，從而間接抑制炎癥的發(fā)生。

模型組IKK蛋白表達水平明顯高于胃萎清高、中、低劑量組及空白組，且胃萎清高、中、低劑量組IKK的表達水平與空白組相當(dāng)，提示胃萎清能在一定程度上能抑制炎癥因子的表達，從而阻斷炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。這主要是因為，IKK能參與由細胞因子引起的細胞內(nèi)免疫反應(yīng)。IKK的激活使IκB被磷酸化，IκB從NF-κB上脫落并被泛素化，使得NF-κB由抑制狀態(tài)被激活，活化的NF-κB轉(zhuǎn)移至細胞核中從而介導(dǎo)一系列的炎癥反應(yīng)。而胃萎清通過抑制TNF-α的表達，從而抑制炎癥的發(fā)生。胃萎清高劑量組的p50蛋白表達水平與模型組相比，提示胃萎清高劑量組對p50蛋白表達水平有下調(diào)趨勢。而p50為NF-κB1，可促使NF-κB入核，激活基因轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，據(jù)此推測較高劑量的胃萎清可能通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮其藥理學(xué)作用。

此外，本研究還提示，胃萎清中、低劑量組較模型組無明顯下降趨勢，可能與藥物濃度有關(guān)，或與通路因子的交叉對話有關(guān)，仍需要課題組下一步加大樣本量后進行更多、更有益、更深入的研究及探討。綜上所述，可以初步認為在蛋白表達水平層面，胃萎清能使NF-κB炎癥通路的致炎因子TNF-α、IKK、p50的表達水平下降從而控制CAG的發(fā)展，但其機制及量效關(guān)系有待進一步研究印證。

[1]羅紅,黃貴華,林華勝,等.PTEN、Bcl-2與慢性萎縮性胃炎相關(guān)性研究進展[J].湖南中醫(yī)雜志,2015,31(11):181-183.

[2]張祖凱,王閣.NF-κB在腫瘤放療中的分子機制[J].重慶醫(yī)學(xué),2014,43(26):3533-3535.

[3]安康.TGEV感染PK-15細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的分子機制[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[4]張桂賢,劉洪斌,劉大衛(wèi).非可控性炎癥與腫瘤相關(guān)性研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2015,21(2):197-201.

[5]侯政昆,劉鳳斌,李培武,等.劉鳳斌教授治療慢性萎縮性胃炎的病例系列挖掘分析和經(jīng)驗總結(jié)[J].中國中藥雜志,2015,40(11):2227-2234.

[6]張德忠,江偉春,劉澤洪,等.腫瘤壞死因子α-308基因多態(tài)性與胃癌患者血清胃蛋白酶原的關(guān)系[J].中華臨床實驗室管理電子雜志,2015,3(4):249-252.

[7]操珍,孫俊寧,王菀菀,等.液相芯片技術(shù)檢測胃癌血清細胞因子的臨床意義[J].腫瘤防治研究,2016,43(10):870-875.

[8]周娟,張夢軍,郭嘉偉,等.TPA致小鼠耳腫脹模型的中性粒細胞聚集及 IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17A 的表達水平研究[J].免疫學(xué)雜志,2012,28(10):872-876.

[9]楊牧祥,蘇鳳哲,于文濤,等.胃炎飲對實驗性膽汁反流性胃炎大鼠胃黏膜TNF-α、IL-8含量的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2009,15(10):738-740.