曾亞桐，張 怡，朱秋菊，童應(yīng)凱

(天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境生物技術(shù)系 天津300384)

0 引 言

隨著人們生活水平的提高，人們對生活質(zhì)量的提升要求迫切。豆粕是畜牧養(yǎng)殖業(yè)行業(yè)需求量相當(dāng)大的蛋白原料。豆粕中的粗蛋白含量達(dá)到 43%～48%，而且由相對平衡的氨基酸組成，賴氨酸達(dá) 2.3%～2.5%[1]。但是相對于動物蛋白來講，豆粕中的蛋白質(zhì)含量較低，并且含有較多的抗?fàn)I養(yǎng)因子，不利于動物消化吸收，從而影響豆粕的利用效率[2]。通過微生物混合發(fā)酵，將豆粕中的粗蛋白分解成小肽，可以大幅度提高豆粕的利用率。

枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生大量的蛋白酶、淀粉酶等活性較高的酶，能夠較好地水解大豆蛋白并降解豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子。芽孢桿菌有不易致死的芽孢，能夠以活菌的狀態(tài)進(jìn)入動物腸道抑制有害菌的生長[3]。產(chǎn)朊假絲酵母可以分泌多種水解酶，有助于提高豆粕中蛋白含量，同時降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量。通過枯草芽孢桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母協(xié)同發(fā)酵，嚴(yán)格控制料水比，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母均為天津農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)系微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌種，于2017年 9月獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種培養(yǎng)基：枯草芽孢桿菌——肉湯培養(yǎng)基產(chǎn)朊假絲酵母——YEPD固體培養(yǎng)基。

樣品培養(yǎng)基：豆粕、微量元素、蒸餾水按照5∶1∶5的比例配置固體培養(yǎng)基，于 121,℃滅菌20,min。

1.1.3 其他藥品

微量元素配比，硫酸鎂、葡萄糖、磷酸二氫鉀按照100,mL中0.001%∶0.1%∶0.5%,進(jìn)行調(diào)配。

淀粉酶活力和糖化酶活力測定所需藥品：pH值為 6.9磷酸鈉緩沖液、1%,淀粉溶液、3，5-二硝基水楊酸顯色劑、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液。

蛋白酶活力測定所需藥品：pH值為 3.5乳酸緩沖液、pH值為 7.0磷酸緩沖液、pH值為 9.9碳酸緩沖液、1%,干酪素、0.4,mol/L三氯乙酸、Folin試劑、0.4,mol/L碳酸鈉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的準(zhǔn)備

各取一環(huán)枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母分別接種到肉湯固體培養(yǎng)基和 YEPD固體培養(yǎng)基上，并分別置于32,℃培養(yǎng)72,h。

1.2.2 樣品的制備

將培養(yǎng)好的菌種制成菌懸液，每 10,g培養(yǎng)基中接種0.5,mL菌懸液，隔12,h取一次樣測其酶活力。

樣品1：加入0.5,mL枯草芽孢桿菌菌懸液；

樣品2：加入0.5,mL產(chǎn)朊假絲酵母菌懸液；

樣品3：加入 0.25,mL枯草芽孢桿菌菌懸液和0.25,mL產(chǎn)朊假絲酵母菌懸液。

1.2.3 糖化酶活力和淀粉酶活力的測定

1.2.3.1 樣品處理

分別稱取1,g樣品1、2、3放于離心管中并標(biāo)記，每管加入 20,mL、pH值為 6.9磷酸鈉緩沖液，3,000,r/min離心10,min，取上清液。

1.2.3.2 淀粉酶測定步驟

取7支試管，按照表1操作。

表1 淀粉酶活力測定方法Tab.1 Amylase activity assay method

1.2.3.3α-淀粉酶活力的測定

將提取酶液置于 70,℃水浴加熱 15,min鈍化 β-淀粉酶后，按照表1進(jìn)行操作。

1.2.4 蛋白酶活力測定

1.2.4.1 樣品處理

樣品1、2、3各稱取3份1,g樣品置于離心管中，用于檢測3種樣品的酸性蛋白酶活力、中性蛋白酶活力、堿性蛋白酶活力。酸性蛋白酶檢測樣品中加入20,mL、pH 值為 3.5的乳酸緩沖液，于 40,℃水浴0.5,h；中性蛋白酶檢測樣品中加入 20,mL、pH 值為7.0磷酸鹽緩沖液，于30,℃水浴0.5,h；堿性蛋白酶檢測樣品中加入20,mL、pH值為9.9的碳酸鹽緩沖液，于 22,℃水浴 0.5,h。處理后樣品3,000,r/min離心10,min，分別取上清液[4-5]。

1.2.4.2 測定步驟

分別取 1,mL待測酶液于樣品管中，相應(yīng)溫度預(yù)熱 5,min，加入相應(yīng)溫度的 1%,干酪素 1,mL，并于相應(yīng)溫度反應(yīng)20,min。迅速取出加入2,mL 0.4,mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)，沉淀過量底物10,min過濾，取反應(yīng)液1,mL，加入5,mL 0.4,mol/L的碳酸鈉溶液，加入1,mL 福林-酚試劑，搖勻，40,℃水浴 20,min，在660,nm波長下比色并記錄。

空白測定，另取一空白管，加入 2,mL 0.4,mol/L的三氯乙酸，再加入1,mL 2%,酪蛋白溶液，40,℃沉淀完全后加入1,mL酶液，其余操作同上，得空白A660[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶活力測定結(jié)果

2.1.1 干酪素標(biāo)準(zhǔn)曲線

以干酪素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制得干酪素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中蛋白酶含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖1所示。

圖1 干酪素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Casein standard curve

2.1.2 堿性蛋白酶活力測定結(jié)果

測定3種樣品的堿性蛋白酶活力，從而得出添加不同菌種對發(fā)酵體系堿性蛋白酶活力的影響，其測定結(jié)果如圖2所示。

圖2 堿性蛋白酶活力Fig.2 Alkaline protease activity

圖2 中產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵豆粕的堿性蛋白酶活力相對于其他兩組最小，前 36,h比較平穩(wěn)，36～48,h酶活力開始上升，由于微生物大量繁殖產(chǎn)生大量CO2，抑制酵母生長，48～60,h酶活力降低，60,h后無氧呼吸產(chǎn)生的丙酮酸與 CO2結(jié)合生成草酰乙酸，促進(jìn)蛋白酶活性增長，72,h上升至最大值 314.4,μg/g；枯草芽孢桿菌單菌發(fā)酵前 36,h一直處于上升趨勢，由于微生物生長繁殖產(chǎn)生大量CO2，抑制細(xì)菌繼續(xù)生長甚至部分細(xì)菌死亡，36,h后酶活力下降，48,h后CO2促進(jìn)中間體的合成酶活力又開始上升，72,h后酶活力達(dá)最大值 498,μg/g；混合菌種發(fā)酵從發(fā)酵開始酶活力一直處于上升趨勢，發(fā)酵 60,h酶活力達(dá)到最大值726,μg /g后開始降低。綜上所述，混合菌種發(fā)酵豆粕的堿性蛋白酶活力最強(qiáng)。

2.1.3 中性蛋白酶活力測定結(jié)果

測定3種樣品的中性蛋白酶活力，判斷添加不同菌種對發(fā)酵體系中性蛋白酶活力的影響，其測定結(jié)果如圖3所示。

圖3 中性蛋白酶活力Fig.3 Neutral protease activity

由圖3可以看出產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵豆粕前 24,h酵母大量增殖，中性蛋白酶活力處于上升趨勢，24,h后 CO2濃度增加，抑制菌體生長酶活力開始下降，60,h后其他酶水解底物提供大量能量和前體，促進(jìn)蛋白酶合成，酶活力上升，72,h達(dá)到最大值235.2,μg/g；枯草芽孢桿菌發(fā)酵前 48,h細(xì)菌進(jìn)行大量增殖，酶活性為上升狀態(tài)且達(dá)到最大值 385.2,μg/g，48,h后 CO2濃度增加，抑制細(xì)菌增長酶活力開始下降；混合菌種發(fā)酵從總體上來看一直處于上升狀態(tài)，酶活力在24～36,h下降后又開始上升?？傮w來講，3組發(fā)酵中混合菌種發(fā)酵效果較兩種單菌發(fā)酵效果更明顯，且酶活性值最大。

2.1.4 酸性蛋白酶活力測定

測定3種樣品的酸性蛋白酶活力，判斷添加不同菌種對發(fā)酵體系酸性蛋白酶活力的影響，其測定結(jié)果如圖4所示。

圖4 酸性蛋白酶活力Fig.4 Acid protease activity

由圖4可知，枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕一直呈上升狀態(tài)，前48,h酸性蛋白酶活力增長緩慢，48,h后酶活力上升趨勢明顯；產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵 24,h前酶活力逐漸降低，24,h后開始上升至 48,h最大值391.2,μg/g，然后開始急劇下降，可能是由于酵母增長繁殖，產(chǎn)生熱量，培養(yǎng)基溫度高于外界恒定培養(yǎng)溫度，導(dǎo)致大部分菌體死亡；混合菌種發(fā)酵前24,h酶活力呈上升趨勢，24～60,h由于菌體大量增殖釋放CO2和熱量，抑制菌體生長，酶活力迅速降低，60,h后可能因?yàn)槠渌傅膮f(xié)同作用，促進(jìn)蛋白酶活力上升，72,h達(dá)到最高點(diǎn) 440.4,μg/g。總體來說，雖然混合菌種發(fā)酵波動較大，但是混合菌種發(fā)酵兩次達(dá)到相對最大值，所以混合菌種發(fā)酵豆粕產(chǎn)酸性蛋白酶活力表現(xiàn)較好。

2.2 糖化酶活力測定結(jié)果

2.2.1 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以麥芽糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(Abs)為縱坐標(biāo)，麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線用于糖化酶和淀粉酶含量的測定，結(jié)果如圖5所示。

2.2.2 糖化酶活性

以 3，5-二硝基水楊酸為顯色劑紫外分光光度法測定3種樣品的糖化酶活力，結(jié)果如圖6所示。

圖6 糖化酶活力Fig.6 Glucoamylase activity

由圖6可知，產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵豆柏糖化酶活力隨時間的增加酶活性逐漸升高，48,h之后酶活性增長平緩?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵豆粕，前36,h大量增殖酶活力逐漸上升，36,h后CO2抑制細(xì)菌的生長，酶活性開始降低，60,h大量的CO2促進(jìn)草酰氨乙酸合成，酶活力上升，72,h達(dá)到最大值 779.596 6,U/mg；混合菌種發(fā)酵豆粕前24,h糖化酶活性上升，菌種大量增殖，產(chǎn)生CO2，24～48,h進(jìn)行無氧呼吸，細(xì)菌中PEP羧化酶和酵母中丙酮酸羧化酶與 CO2結(jié)合，生成大量草酰乙酸，促進(jìn)氨基酸前體與蛋白質(zhì)合成[7]，60,h糖化酶活性達(dá)到最大值 806.646 7,U/mg。綜上所述，混合菌種發(fā)酵豆粕的糖化酶活力最強(qiáng)。

2.2.3 α-淀粉酶活性的測定

測定 3種樣品的 α-淀粉酶活力，判斷添加不同菌種對發(fā)酵體系α-淀粉酶活力的影響，其測定結(jié)果如圖7所示。

圖7α-淀粉酶活力Fig.7 Alpha-amylase activity

由圖7可知，枯草芽孢桿菌發(fā)酵期間，36～60,hα-淀粉酶活性最低，可能是因?yàn)榫w增殖后產(chǎn)生的CO2和熱量影響了蛋白酶酶活性，60,h后酶活性增強(qiáng)，可能是其他酶的協(xié)同作用，在 72,h達(dá)到最大值；產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵期間，前36,h酶活力迅速上升，酵母大量增殖，36～72,h酶活力上升緩慢并在 72,h達(dá)到最大值748.560 2,U/g；混合菌種發(fā)酵期間，前36,h酶活力上升緩慢，在 24,h和 60,h都出現(xiàn)高峰值，36～48,h酶活力減弱，可能是由于細(xì)胞呼吸作用產(chǎn)生大量 CO2和熱量，抑制了細(xì)胞的生長，48～60,h酶活力增強(qiáng)，可能是因?yàn)榧?xì)胞中 NH4+與培養(yǎng)基中 K+結(jié)合，激活α-淀粉酶[7-8]，24,h達(dá)到最大值 762.84,U/g，整體高于2種單菌發(fā)酵值，說明枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的α-淀粉酶活力增強(qiáng)了產(chǎn)朊假絲酵母的α-淀粉酶活力。

2.2.4 β-淀粉酶活力測定

計算 3種樣品的 β-淀粉酶活力，判斷添加不同菌種對發(fā)酵體系β-淀粉酶活力的影響，其結(jié)果如圖8所示。

圖8 β-淀粉酶活力Fig.8 β-amylase activity

由圖8可知，枯草芽孢桿菌發(fā)酵前 24,h迅速上升至酶活力最大值 32.063 5,U/g，24～48,h酶活力下降，48～60,h上升后再次下降；產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵在12,h下降，36,h上升，48,h后下降，60,h后酶活力趨近于平穩(wěn)；混合菌種發(fā)酵在 24,h酶活力達(dá)到最大值49.225 1,U/g后開始下降，60,h后上升?？莶菅挎邨U菌與產(chǎn)朊假絲酵母單菌發(fā)酵，酶活性都出現(xiàn)了上升后下降再上升的走勢，第一次酶活力降低可能由于細(xì)胞增殖產(chǎn)熱，抑制菌體生長，第二次酶活力增強(qiáng)可能是培養(yǎng)基內(nèi)的Mg2+增強(qiáng)了β-淀粉酶活力[8]。綜合來講，混合菌種發(fā)酵酶活力相對最強(qiáng)。

3 討 論

①豆粕主要以粗蛋白為主。所以發(fā)酵豆粕要以降解粗蛋白為主要目的，通過對蛋白酶活力測定，可以確定降解粗蛋白的時間。混合菌種發(fā)酵 60～72,h之間蛋白酶活性比較強(qiáng)。

除了粗蛋白，豆粕中含有一定的糖類物質(zhì)，通過對淀粉酶活力的測定，混合菌種發(fā)酵 24,h淀粉酶活性比較強(qiáng)。綜合比較發(fā)現(xiàn)，混菌發(fā)酵體系中，糖類物質(zhì)會先一步被分解，然后再逐步分解蛋白質(zhì)。

②枯草芽孢桿菌中有 PEP羧化酶，而產(chǎn)朊假絲酵母有丙酮酸羧化酶，二者均可以與 CO2結(jié)合產(chǎn)生草酰乙酸，促進(jìn)氨基酸代謝，從而促進(jìn)胞內(nèi)蛋白的合成，所以混合發(fā)酵中枯草芽孢桿菌對產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵具有協(xié)同作用。

4 結(jié) 論

在一定培養(yǎng)時間范圍內(nèi)，枯草芽孢桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母混合發(fā)酵具有協(xié)同作用，通過分別測定蛋白酶和糖化酶活力，顯示枯草芽孢桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母混合菌種發(fā)酵效果最好，發(fā)酵 60～72,h其蛋白酶活力最高，發(fā)酵24,h其淀粉酶活力最高。