甄廣懷 李磊邦 甄美嬋 梅秀云 周玉萍

（廣東省臺(tái)山市人民醫(yī)院 廣東 臺(tái)山 529200）

妊娠高血壓綜合征（簡(jiǎn)稱(chēng)妊高征），是孕婦妊娠期常見(jiàn)的高發(fā)病，主要出現(xiàn)在妊娠20周到產(chǎn)后兩周，發(fā)病率大約占孕婦總數(shù)的5%，該病嚴(yán)重威脅母嬰健康，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生兒病率和死亡的常見(jiàn)疾病之一。妊娠高血壓發(fā)生的原因很多，具體還不是太明確。但最近研究發(fā)現(xiàn)，亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因677C/T多態(tài)性與妊高征發(fā)病關(guān)系密切[1]，而高同型半胱氨酸（HCY）血癥可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷并可能是妊高征的發(fā)病原因之一[2-3]。為此，本研究旨在探討亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性、同型半胱氨酸與妊娠高血壓綜合征的相關(guān)性，為進(jìn)一步尋找妊高征的病因及防治提供依據(jù)，從而利于優(yōu)生優(yōu)育。

1.資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016年6月至2017年12月期間在本院登記進(jìn)行產(chǎn)前檢查的妊娠高血壓綜合癥孕婦37例作為妊高征組，年齡24～44歲，平均19.0±4歲，孕周21～39周，平均16±2周，診斷標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)樂(lè)杰主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》第7版。另對(duì)照組40例，均為隨機(jī)選取的與妊高征組同期的正常健康孕婦，平均年齡26±3歲，孕周24±2周。

1.2 方法

1.2.1 亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因677C/T檢測(cè)：（1）DNA提取：抽取孕婦外周靜脈血2～3ml EDTA-K2抗凝全血，按DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）說(shuō)明書(shū)要求操作。采用可以特異性結(jié)合DNA離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)，提取血液中的基因組DNA。（2）MTHFR基因PCR擴(kuò)增，使用達(dá)安基因公司DA7600Ⅱ型熒光分析儀，試劑盒由江西諾德醫(yī)療器械有限公司提供。按操作程序進(jìn)行，將配置好的反應(yīng)管放入儀器通道內(nèi)，儀器運(yùn)行加熱程序如下：步驟一，95℃10分鐘，激活熒光基團(tuán)；步驟二，95℃15秒，使樣本變性；步驟三，60℃40秒，使熒光基團(tuán)與樣本充分結(jié)合；重復(fù)二、三步驟四十次；步驟四，室溫冷卻1分鐘，完成反應(yīng)。信號(hào)收集：60℃收集FAM和VIC信號(hào)。不同的熒光基因與相對(duì)應(yīng)位置的氨基酸特異結(jié)合后，會(huì)發(fā)出不同顏色的熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)最終的熒光信號(hào)曲線，確定檢測(cè)樣本中亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因?qū)?yīng)位置的氨基酸情況，反映MTHFR基因的活性。

1.2.2 血清同型半胱氨酸（HCY）測(cè)定：抽取研究對(duì)象空腹靜脈全血3ml，放入干燥試管內(nèi)送檢。標(biāo)本于室溫下離心10分鐘，分離血清后上機(jī)測(cè)定HCY濃度。檢測(cè)試劑盒為北京九強(qiáng)公司的雙液體試劑，利用酶法進(jìn)行測(cè)定，配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品；檢測(cè)儀器為西門(mén)子ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀。按相應(yīng)說(shuō)明書(shū)設(shè)置參數(shù)和操作，質(zhì)控在控之下測(cè)定標(biāo)本。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 MTHFR基因677C/T分布情況：

妊高征組中，MTHFR基因677位點(diǎn)三種基因型分布如下：CC野生型11例，占比30%，CT雜合型17例，占比46%，TT突變型9例，占比24%。而在對(duì)照組中，上述三種基因型分別為22例、14例、4例，占比分別為55%、35%和10%。妊高征組的TT突變基因型頻率24%明顯高于正常組的10%（P＜0.05）；同時(shí)，妊高征組T等位基因頻率47%也明顯高于正常組的28%（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩組孕婦MTHFR基因型與等位基因分布情況[n（%）]

2.2 血清同型半胱氨酸（HCY）濃度

妊高征組HCY濃度平均值為14.1±2.3μmol/L，而對(duì)照組為8.3±1.6μmol/L，兩組濃度水平差異有極顯著性（P＜0.01）。同時(shí)，妊高征組MTHFR基因677位點(diǎn)3種基因型的HCY濃度分別為：CC 9.0±3.1μmol/L、CT 13.5±2.5μmol/L 、TT 18.3±5.0μmol/L；相應(yīng)對(duì)照組為7.1±2.2μmol/L、10.3±3.2μmol/L、15.1±4.0μmol/ L。在所有研究對(duì)象中，TT基因型的HCY濃度均顯著高于CC基因型（P＜0.05）；3種基因型的HCY濃度，妊高征組均高于對(duì)照組，但均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 MTHFR不同基因型血清HCY濃度（±s，μmol/ L）

表2 MTHFR不同基因型血清HCY濃度（±s，μmol/ L）

組別 n CC CT TT妊高征組 37 9.0±3.1 13.5±2.5 18.3±5.0對(duì)照組 40 7.1±2.2 10.3±3.2 15.1±4.0

3.討論

3.1 MTHFR基因與妊高征

亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是葉酸及同型半胱氨酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶。其主要作用是催化5，10，-亞甲基四氫葉酸形成5-甲基四氫葉酸，5-甲基四氫葉酸為HCY轉(zhuǎn)化為蛋氨酸提供受體。蛋氨酸是體內(nèi)各種代謝中甲基反應(yīng)的直接供體-S-腺苷蛋氨酸（SAM）的前體，SAM經(jīng)脫腺苷生成HCY，HCY可通過(guò)N-5-甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶及其輔酶維生素B12的催化作用，重新生成蛋氨酸，此過(guò)程又是已知體內(nèi)能利用N-5-甲基四氫葉酸的唯一反應(yīng)。MTHFR基因位于染色體的1P36.3[4]，具有多態(tài)性，特別是當(dāng)677位C→T突變后，此位點(diǎn)的氨基酸由丙氨酸轉(zhuǎn)化為纈氨酸，導(dǎo)致MTHFR酶活性下降，5-甲基四氫葉酸生成不足，血漿HCY濃度增高，是妊娠高血壓綜合征、習(xí)慣性流產(chǎn)、胎盤(pán)血管疾病等妊娠相關(guān)疾病的高危因素[5]。

本研究表明，妊高征組TT突變基因型頻率及等位基因T的頻率均明顯高于對(duì)照組，提示MTHFR基因677C/T多態(tài)性可能是妊高征發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)遺傳因素，并作為遺傳因素通過(guò)影響HCY的代謝從而引起妊高征。

3.2 高HCY與妊高征

HCY是一種含硫的氨基酸，由蛋氨酸通過(guò)蛋氨酸循環(huán)脫甲基作用產(chǎn)生。HCY濃度水平升高與遺傳和營(yíng)養(yǎng)因素有關(guān)，遺傳因素包括胱硫醚β合成酶缺乏和MTHFR酶活性降低。研究表明[6]，MTHFR基因677C/T多態(tài)性可致MTHFR酶活性降低，從而影響HCY代謝，導(dǎo)致血中HCY濃度升高。飲食原因主要是葉酸和維生素B12缺乏，兩者是HCY代謝的主要輔助因子。所以HCY代謝過(guò)程中任何關(guān)鍵酶或輔助因子的缺乏，均可導(dǎo)致HCY的代謝障礙，從而引起高HCY血癥。

本研究結(jié)果表明，妊高征組血清HCY濃度平均值顯著高于對(duì)照組。目前認(rèn)為[7]，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是妊高征發(fā)生病理變化的基礎(chǔ)，而高HCY可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，是多因素綜合作用的結(jié)果，其主要機(jī)理包括HCY可在金屬離子介導(dǎo)下自身氧化生成過(guò)氧化物及氧自由基，損傷內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[8]，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，可使內(nèi)皮素Ⅰ分泌增加，血管內(nèi)皮衍生松馳因子及前列環(huán)素分泌減少，導(dǎo)致患者血管舒縮因子平衡紊亂，從而引發(fā)妊高征。

3.3 MTHFR基因多態(tài)性、高HCY與妊高征相關(guān)性分析

綜上所述，在MTHFR基因多態(tài)性、高HCY及妊高征三者中，MTHFR基因677C/T多態(tài)性導(dǎo)致MTHFR酶活性下降，影響了HCY的正常代謝，HCY代謝障礙導(dǎo)致高HCY血癥，而高HCY血癥是引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要原因，從而容易誘發(fā)妊高征?？梢?jiàn)，高HCY是三者中的中心和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，當(dāng)血液中HCY濃度升高，可以造成人體血管堵塞，甚至血壓增高[9]。本研究顯示，攜帶MTHFR基因TT突變基因型的孕婦容易導(dǎo)致高HCY血癥發(fā)生，進(jìn)而易引起妊高征，而妊高征組的HCY平均水平也明顯高于對(duì)照組，所有研究對(duì)象中，TT突變基因型均明顯高于對(duì)照組。具體到每個(gè)基因組，雖然妊高征組均高于對(duì)照組，但差別無(wú)顯著性（P＞0.05），可能和觀察例數(shù)偏少及分布有關(guān)，同時(shí)也說(shuō)明，MTHFR基因多態(tài)性對(duì)高HCY水平的影響較大和直接，而高HCY水平只是引起妊高征的其中一個(gè)原因。另外，HCY代謝過(guò)程中存在著基因與營(yíng)養(yǎng)因素的相互作用，孕婦在妊娠前后大都已服用葉酸，增加葉酸補(bǔ)充在一定程序上彌補(bǔ)MTHFR基因多態(tài)性所引起的影響[10]，有利于降低HCY濃度，從而對(duì)本研究的結(jié)論造成一定的影響。

總之，本研究表明，MTHFR基因677C/T多態(tài)性及高HCY與妊高征存在著相互關(guān)系。從優(yōu)生優(yōu)育的角度出發(fā)，應(yīng)普及推廣MTHFR基因677C/T多態(tài)性及HCY在孕前、孕期的檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果個(gè)體化葉酸的補(bǔ)充，確保孕婦和胎兒的安全。

[1]李克深，孫延芝，等.妊娠高血壓綜合征患者亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與血漿中同型半胱氨酸水平測(cè)定[J].中華婦產(chǎn)科雜志 ,2000,35（4）：205-207

[2]林其德.妊高征病因?qū)W研究的進(jìn)展[J].中華婦產(chǎn)科雜志 ,1997,32：3-4

[3]McCully KS.Homocysteine and vascular disease.Nat Med,1996,2：386-389

[4]Goyette P, Summer JS, Milos R, et al.Human methylenetetrahydrofolatereduct ase ：i solation of cDNA,mapping and mutationidentification.Nat Genet,1994,7：195-200.

[5]Frosst P, Blom HJ, Milos R, et al. A candidate geneticrisk factor for vascular disease： a common mutation inmethylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet,1995,10(1)：111-3.

[6]黃泳華，羅中明，等.同型半胱氨酸、葉酸、維生素B12與妊娠高血壓綜合征發(fā)病的關(guān)系.中華婦產(chǎn)科雜志，2002，37（4）：208-210.

[7]黃華,梁紅梅，等.孕婦血清同型半胱氨酸、葉酸、維生素B12水平與妊娠高血壓綜合征關(guān)系探討.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志 ,2014,35(21)：2869-2871

[8]王玉芳.同型半胱氨酸致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志 ,1998,6：259-263.

[9]林小慧,劉開(kāi)祥,曾愛(ài)源,等.高血壓患者血漿同型半胱氨酸水平及亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性的研究[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2012，20（5）：777-779.

[10]韓紅敬，沈浣，等.亞甲基四氫葉酸還原酶基因677位多態(tài)性、高同型半胱氨酸血癥與復(fù)發(fā)性流產(chǎn).生殖與避孕，2012，32（7）：486-489