王大清 郭繼彤 李喜和 趙高平 曹貴方

摘 要：該研究旨在探討外源Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟的調(diào)控作用。在成熟培養(yǎng)液中分別添加濃度為0、100、200和300ng/mL的Ghrelin，進(jìn)行綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)，成熟培養(yǎng)24h，觀察統(tǒng)計(jì)處于MII期的細(xì)胞數(shù)目。選擇最佳添加濃度，在體外成熟培養(yǎng)0、6、8、14、16、24h，通過(guò)Hoechst33342染色持續(xù)檢測(cè)卵細(xì)胞中細(xì)胞核成熟隨時(shí)間變化，并對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，以證明細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。成熟培養(yǎng)24h時(shí)，添加0、100、200、300 ng/mLGhrelin組卵母細(xì)胞成熟率分別為：63.7% （220/345） 、69.4%（230/332）、85.6% （270/316）、75.9%（231/305）。200ng/mL Ghrelin組顯著高于對(duì)照組（P<0.01），其余組并未顯著高于對(duì)照組 （P<0.05）；染色證明：200ng/mL Ghrelin組于成熟培養(yǎng)0h、6h、14h、16h到達(dá)GV、GVBD、MI、MII期（P<0.05）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR證明：對(duì)卵母細(xì)胞成熟GV、GVBD、MI、MII 期，Ghrelin受體基因GHSR-1a和卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)基因OCT-4、GLUT1 和IFNT 的相對(duì)表達(dá)時(shí)間提前，但并不顯著影響這些基因的表達(dá)水平。外源 Ghrelin參與了綿羊卵母細(xì)胞的體外成熟調(diào)控，可在沒(méi)有改變其成熟過(guò)程的前提下加速卵母細(xì)胞的體外成熟過(guò)程，但對(duì)綿羊卵母細(xì)胞的質(zhì)量和進(jìn)一步發(fā)育相關(guān)的基因的表達(dá)沒(méi)有明顯影響。

關(guān)鍵詞：綿羊卵母細(xì)胞；Ghrelin；體外成熟

中圖分類(lèi)號(hào) S826 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）07-

Effects of Ghrelin on in Vitro Maturation of Ovine Oocytes

Wang Daqing1 et al.

（1College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

Abstract：To study the regulation effect of exogenous Ghrelin in vitro maturation of sheep oocytes，0，100，200 and 300 ng/mL Ghrelin were added in mature culture medium，in vitro culture of sheep oocytes and 24h in mature culture，and the observation statistics were in the number of MII period. To choose the best dosage and mature in vitroculture 0，6，8，14，16，24 h，continuous detection of egg in the nucleus by dyeing Hoechst33342 mature and change over time，and the real-time fluorescent quantitative PCR to detect cell culture period，to show that cell quality relative expression of related genes. When the mature culture was incubated for 24h，the maturation rate of the oocytes of 0，100，200，300ng/mLGhrelin group was 63.7%（220/345），69.4%（230/332），85.6% （270/316） and 75.9%（231/305）. The 200ng/mL Ghrelin group was significantly higher than the control group（P<0.01），while the remaining group was not significantly higher than the control group （P<0.05）. The results showed that 200 ng/mL Ghrelin group was established in mature culture 0h，6h，14h，16h to GV，GVBD，MI，MII （P<0.05）. Real-time fluorescent quantitative PCR to prove：the GV oocytes mature，GVBD，MI，MII，Ghrelin receptor gene GHSR - 1a and oocyte quality related gene OCT - 4，the relative expression of GLUT1 and IFNT ahead of time，but not dramatically affect the gene expression level.exogenous Ghrelin participated in the sheep oocyte in vitro maturation regulation，under the premise of no change in the mature process can be accelerated in vitro maturation of oocytes，but the quality of sheep oocytes and related gene expression did not significantly affect the further development

Key words：Sheep oocytes；Ghrelin； In vitro maturation

Ghrelin是日本科學(xué)家Kojima于1999年首次發(fā)現(xiàn)的一種由28個(gè)氨基酸組成的新的內(nèi)源性腦腸肽，是生長(zhǎng)激素促分泌素受體（Growth hormone secretagogue receptor，GHSR）的天然配體[1]。Ghrelin在體內(nèi)分布廣泛，可能參與了多種組織的生理功能調(diào)控[2]。那么，Ghrelin在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)作中扮演著何種角色，探索外源Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟的調(diào)控機(jī)理對(duì)其后的體外受精、胚胎發(fā)育、轉(zhuǎn)基因克隆等技術(shù)有著重要意義。近來(lái)研究證實(shí)：Ghrelin參與了哺乳動(dòng)物生殖功能的調(diào)控[3]。在不同動(dòng)物物種中其作用不盡相同。在豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)添加Ghrelin可提高豬體外受精和孤雌胚胎的囊胚發(fā)育率[4]；而在牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中，Ghrelin除了可加速卵母細(xì)胞的體外成熟，還抑制了其后體外受精胚胎的囊胚發(fā)育[5]。在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟和受精卵的體外培養(yǎng)過(guò)程中添加低濃度Ghrelin可提高體囊胚的體外發(fā)育率，但高濃度則抑制外胚囊胚的發(fā)育[6]。

本研究在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的Ghrelin，檢測(cè)并觀察不同濃度Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟率和卵母細(xì)胞核成熟時(shí)間的影響，篩選提高綿羊卵母細(xì)胞完全體外成熟率的最佳外源Ghrelin濃度。同時(shí)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)卵母細(xì)胞成熟不同時(shí)期細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了動(dòng)態(tài)檢測(cè)，探討Ghrelin與綿羊卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)期的相關(guān)性，認(rèn)識(shí)并了解Ghrelin影響綿羊卵母細(xì)胞成熟的作用機(jī)理。進(jìn)而通過(guò)在綿羊卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加最佳外源Ghrelin濃度，來(lái)有效提高綿羊卵母細(xì)胞體外成熟數(shù)量和質(zhì)量，為其后的體外受精、胚胎發(fā)育、轉(zhuǎn)基因克隆等技術(shù)提供最基礎(chǔ)、最有效保障。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)外源添加Ghrelin（PGH-3625-PI）購(gòu)置于Peptides公司。HM199、M199、EGF、LH、DPBS、Gentamicin購(gòu)于Gibco公司。胎牛血清是Biological Industries公司產(chǎn)品。The RNeasy? Mini Kit（cat.nos.74104）試劑盒購(gòu)于Qiagen公司。GoScriptTM Reverse Transcription System試劑盒購(gòu)于Promega公司。體視顯微鏡SMZ745T是Nikon公司生產(chǎn)。Real-Time PCR 儀（5100型號(hào)）是Thermo公司生產(chǎn)。微孔板迷你離心機(jī)（ZHmini-p25）為浙江藏漢科技有限公司產(chǎn)品。CO2培養(yǎng)箱（NUAIR-NU-5510E型號(hào)）為NUAIRE公司產(chǎn)品。綿羊卵巢采集自內(nèi)蒙古和林格爾內(nèi)蒙古蒙羊牧業(yè)股份有限公司屠宰車(chē)間。采集的卵巢置于含0.3mg/mL慶大霉素的生理鹽水，在22℃的保溫桶中1h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綿羊卵母細(xì)胞的采集和體外成熟培養(yǎng) 將運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室的綿羊卵巢先用75%酒精浸泡20～30s，之后用DPBS清洗3次，置于割卵液（90%HM199+10%FBS+2.5μg/mL

Heparin+50μg/ mLGentamicin）中，采用切割法收集2～6mm直徑的卵泡中的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus oocyte complexes，COCs），在體視鏡下挑選具有3層以上卵丘細(xì)胞、胞質(zhì)均勻、形態(tài)正常的卵母細(xì)胞用于成熟培養(yǎng)。每50枚COCs放于含有600μL基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)液（90%M199+10%FBS+0.3mm/mLSodiumpyruvate+0.1mm/mLCysteamine

+5μg/mLFH+5μg/mLLH+10μg/mLEGF+1μg/mLE2+50μg/mL

Gentamicin）的4孔板（Corning）中，4孔板中央添加2.5mL超純H2O，在38.5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行成熟培養(yǎng)。為了比較不同濃度梯度Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響，分別設(shè)基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)液中添加100、200、300ng/mL Ghrelin為實(shí)驗(yàn)組；基礎(chǔ)成熟培養(yǎng)液中添加0ng/mL Ghrelin為對(duì)照組。然后分別于成熟培養(yǎng)24h收集培養(yǎng)的卵母細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞處于：MII期成熟率百分比及標(biāo)準(zhǔn)誤差。

1.2.2 綿羊卵母細(xì)胞核成熟進(jìn)程的檢測(cè) 基礎(chǔ)成熟液中添加0ng/mLGhrelin和200ng/mLGhrelin組，分別設(shè)為：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。在熒光顯微鏡下，持續(xù)觀察對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中核發(fā)育形態(tài)隨時(shí)間的變化，以確定對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組卵母細(xì)胞核成熟期（GV、GVBD、MI、MII）進(jìn)程隨時(shí)間的變化。并于成熟培養(yǎng)0h、8h、16h、24h；0h、6h、14h、16h后分別收集各時(shí)間培養(yǎng)卵母細(xì)胞各100枚，分別放在含有0.1%透明質(zhì)酸酶的培養(yǎng)液中振蕩去掉卵丘細(xì)胞，DPBS+0.3%BSA洗1遍，在加有PBS+4%多聚甲+0.2%TritonX-100的4孔板中，38.5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中固定通透1h，PBS+0.3%BSA洗3遍（0.3%的BSA起到封閉作用），用Hoechst 33342（5mg/mL）染色檢查卵母細(xì)胞核成熟GV、GVBD、MI、MII期核成熟進(jìn)程。最后，用甘油：PBS按1∶1配制的封片液封片。熒光顯微鏡400倍下，觀察核發(fā)育形態(tài)變化。并3次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)不同核形態(tài)時(shí)期卵母細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間變化。

1.2.3 綿羊卵母細(xì)胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及OCT-4、GLUT1、IFNT、GHSR-1a、GHSR-1a和GAPDH基因的熒光定量PCR檢測(cè)

1.2.3.1 綿羊卵母細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按照The RNeasy? Mini Kit（cat.nos.74104）微量RNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)從不同體外成熟培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中提取總RNA。然后，將總RNA按照GoScriptTM Reverse Transcription System試劑盒的說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。-20℃保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)依據(jù)美國(guó)GenBank 公布的基因的序列，使用Primer6.0軟件計(jì)所需引物。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物序列（見(jiàn)表1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)程序?yàn)椋簡(jiǎn)我蜃臃讲罘治觯╫ne-way ANOVA）、Tukey，s Multiple Comparison test。數(shù)據(jù)表示分別以：百分比：%和標(biāo)準(zhǔn)誤差：SEM；即：%±SEM，且每組卵母細(xì)胞個(gè)數(shù)多余100個(gè)，每組間重復(fù)3次，組間重復(fù)3次；t檢驗(yàn)結(jié)果表示：a，p<0.01時(shí)為差異極顯著；b，p<0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響 于體外成熟培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)的卵母細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞處于MII期百分比。對(duì)照組：63.7%（P<0.05）；添加100ng/mL Ghrelin組：69.4%（P<0.01）、添加200ng/mL Ghrelin組：85.6%（P<0.01）、添加300ng/mL Ghrelin組：75.9%（P<0.01）。結(jié)果表明：添加100、200、300ng/mL Ghrelin在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)均有一定的促進(jìn)作用，其中添加200ng/mL Ghrelin組作用最為顯著（P<0.01），其中添加300 ng/mL Ghrelin組、100ng/mL Ghrelin組作用次之（P<0.01）（見(jiàn)表2）。

2.2 卵母細(xì)胞核成熟隨時(shí)間變化

2.2.1 Hoechst 33342對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)細(xì)胞染色 結(jié)果顯示：對(duì)照組（A、B、C、D）：卵母細(xì)胞于體外培養(yǎng)的0h到達(dá)卵母細(xì)胞生發(fā)泡期（GV）：A、8h到達(dá)卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂期（GVBD）：B、16h到達(dá)卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂中期（MI）：C、24h到達(dá)卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂中期（MII）：D；實(shí)驗(yàn)組（A′、B′、C′、D′）：卵母細(xì)胞于體外培養(yǎng)的0h到達(dá)GV：A′、6h到達(dá)GVBD：B′、14h到達(dá)MI：C′、16h到達(dá)MII：D′。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，細(xì)胞核發(fā)育形態(tài)趨勢(shì)和對(duì)照組基本一致（P<0.05）。

2.2.2 綿羊卵母細(xì)胞核成熟情況隨時(shí)間變化 對(duì)照組：卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)0h：97%到達(dá)GV期（p<0.01）、8h：52.46%到達(dá)GVBD期（p<0.01）、16h：54.54%到達(dá)MI期（p<0.01）、24h：56.42%到達(dá)MII期（p<0.01）；實(shí)驗(yàn)組：卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)0h：92.54%到達(dá)GV期（p<0.01）；6h：62.77%到達(dá)GVBD期（p<0.01）、14h：66.84%到達(dá)MI期（p<0.01）、16h：64.03%到達(dá)MII期（p<0.01）。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組在沒(méi)有改變卵母細(xì)胞成熟進(jìn)程的同時(shí)，對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟有一定的加速作用（見(jiàn)表3、4）。

2.3 卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中OCT-4、GLUT1、IFNT、GHSR-1a、和GAPDH基因相對(duì)表達(dá)量 對(duì)照組（見(jiàn)圖2）：卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，OCT-4在GV期、GVBD期、MI期、MII期相對(duì)表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化，在IVM過(guò)程中基本維持不變；GLUT1的相對(duì)表達(dá)量在GVBD期降低，MI期、MII期持續(xù)增加，MII期GLUT1的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大，為初始相對(duì)表達(dá)量的1.4倍；IFNT在GVBD期、MI期、MII期表達(dá)量不斷增加，GVBD期IFNT的表達(dá)量為初始量的1.69倍，MI期為初始量的1.4倍，MII期達(dá)到最大，為初始量的1.75倍；Ghrelin受體GHSR-1a的相對(duì)表達(dá)量在IVM過(guò)程中呈緩慢遞減趨勢(shì)變化，Ghrelin受體GHSR-1a在MII期相對(duì)表達(dá)量遞減趨勢(shì)明顯，為初始相對(duì)表達(dá)量的-0.2倍。實(shí)驗(yàn)組（見(jiàn)圖3）：卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，Ghrelin受體GHSR-1a基因和卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)基因OCT4、GLUT-1和IFNT隨著卵母細(xì)胞成熟過(guò)程的表達(dá)動(dòng)態(tài)。其中OCT-4在GV期、GVBD期、MI期、MII期相對(duì)表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化，GVBD期的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高為初始表達(dá)量的1.2倍，OCT-4的相對(duì)表達(dá)量在IVM過(guò)程中基本維持不變；GLUT1的相對(duì)表達(dá)量在GV期、GVBD期，MI期、MII期持續(xù)快速增加，MII期GLUT1的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大，為初始相對(duì)表達(dá)量的1.26倍；IFNT在GVBD期、MI期、MII期表達(dá)量不斷增加，GVBD期IFNT的表達(dá)量為初始量的1.29倍，MI期為初始量的1.43倍，MII期達(dá)到最大，為初始量的1.90倍；Ghrelin受體GHSR-1a的相對(duì)表達(dá)量隨著IVM時(shí)間的推進(jìn)呈下降趨勢(shì)變化，當(dāng)?shù)竭_(dá)MII期時(shí)Ghrelin受體GHSR-1a相對(duì)表達(dá)量到達(dá)相對(duì)表達(dá)量的最低點(diǎn)，為初始量的0.315倍。結(jié)果說(shuō)明（見(jiàn)圖2、圖3）：在實(shí)驗(yàn)組并沒(méi)有影響卵母細(xì)胞Ghrelin受體GHSR-1a基因和卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)基因OCT4、GLUT-1和IFNT的表達(dá)水平，僅提前表達(dá)了相關(guān)基因的表達(dá)；GV期：實(shí)驗(yàn)組GHSR-1a基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組而言差異顯著（p<0.05）、GVBD期：實(shí)驗(yàn)組GHSR-1a基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組差異極顯著（p<0.01）、MII期：實(shí)驗(yàn)組GLUT1基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組差異顯著（p<0.05）。

3 討論

本研究證實(shí)添加Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟具有促進(jìn)作用，這與白瑞霞等[7]的研究結(jié)果相吻合，但對(duì)于Ghrelin的適宜添加量，各種報(bào)道中有所不同。本研究結(jié)果顯示，添加200ng/mL的Ghrelin培養(yǎng)條件可獲得理想的成熟效果，而王正光等[8]的研究則認(rèn)為添加50ng/mL Ghrelin培養(yǎng)條件對(duì)卵母細(xì)胞的成熟及后續(xù)的胚胎發(fā)育最為合適的，這可能與不同實(shí)驗(yàn)室采用的培養(yǎng)體系有所不同有關(guān)。本研究就外源添加一定濃度Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響進(jìn)行探索研究，以期為胚胎生產(chǎn)及細(xì)胞工程的基礎(chǔ)研究進(jìn)一步奠定一定的理論基礎(chǔ)。

GHSR-1a是Ghrelin的一個(gè)受體亞型[9]，它的分布十分廣泛，在多種分泌作用中發(fā)揮作用[10]。Ghrelin的生物學(xué)作用是通過(guò)與GHSR-1a受體特異性結(jié)合而實(shí)現(xiàn)得。與以前報(bào)道的研究結(jié)果一致[11]，本研究經(jīng)過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ghrelin受體GHSR-1a在體外成熟培養(yǎng)條件下，其相對(duì)表達(dá)量均隨著成熟進(jìn)程的發(fā)育而減弱直到MII期達(dá)到最小，在添加Ghrelin后，GHSR-1a的表達(dá)提前了。這可能是由于添加外源Ghrelin后，刺激了Ghrelin受體GHSR-1a的表達(dá)，二者通過(guò)結(jié)合產(chǎn)生作用。而當(dāng)卵母細(xì)胞成熟完成后，Ghrelin完成了對(duì)卵母細(xì)胞成熟的調(diào)節(jié)，或者是Ghrelin被消耗，而致使其受體的表達(dá)量也下降。這些都表明Ghrelin通過(guò)調(diào)節(jié)受體GHSR-1a的表達(dá)而參與了綿羊卵母細(xì)胞的體外成熟過(guò)程。

在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，Pit-oct-unc轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OCT-4的表達(dá)是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵[12]，不僅如此，卵母細(xì)胞母源OCT-4的mRNA水平也是卵母細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育所必不可少的[13]。也就是說(shuō)，卵母細(xì)胞OCT-4的mRNA水平發(fā)生改變，會(huì)影響到卵母細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育。我們的研究發(fā)現(xiàn)成熟液中添加Ghrelin對(duì)母系來(lái)源的OCT-4沒(méi)有影響。這表明添加Ghrelin，在提高綿羊卵母細(xì)胞體外成熟率的同時(shí)，不影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量，也不影響其后的進(jìn)一步發(fā)育。

有研究發(fā)現(xiàn)GLUT1，一類(lèi)協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超級(jí)家族的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[14]，參與了卵母細(xì)胞和早期胚胎的代謝[15]。GLUT1影響卵母細(xì)胞的成熟和植入前胚胎的發(fā)育[16]，而且GLUT1的表達(dá)量和綿羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力呈正相關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞體外成熟液中添加Ghrelin可以顯著提高綿羊卵母細(xì)胞的成熟率，縮短卵母細(xì)胞成熟時(shí)間，期間GLUT1的表達(dá)也隨著卵母細(xì)胞成熟進(jìn)程的加快而提前。這可能是GLUT1通過(guò)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的作用，參與了卵母細(xì)胞的成熟調(diào)節(jié)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)Ghrelin除了調(diào)節(jié)GLUT1基因的提前表達(dá)參與卵母細(xì)胞體外成熟外，也參與了IFNT基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。IFNT基因是卵丘細(xì)胞的標(biāo)記基因之一，在早期胚胎的表達(dá)有助于胚胎的植入識(shí)別[19]。

已有研究表明：IFNT最初是在綿羊孕體條件培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的[20]，參與多種功能的調(diào)節(jié)[21]。IFNT還與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能相關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)：IFNT和GLUT1基因的表達(dá)調(diào)節(jié)一樣，Ghrelin通過(guò)調(diào)節(jié)IFNT基因的提前表達(dá)參與卵母細(xì)胞體外成熟，但不改變IFNT基因在卵母細(xì)胞成熟進(jìn)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，從而維持卵母細(xì)胞提前成熟，而不改變其質(zhì)量和進(jìn)一步發(fā)育的能力。本研究通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)不同濃度的Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟有不同影響，一定濃度Ghrelin能顯著提高卵母細(xì)胞的成熟率。在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加一定濃度Ghrelin，綿羊卵母細(xì)胞的成熟時(shí)間縮短。這些結(jié)果表明，Ghrelin介導(dǎo)了綿羊卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)，這可能是由于Ghrelin能促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞的代謝，從而加快了卵母細(xì)胞的成熟。本試驗(yàn)為后續(xù)進(jìn)一步研究外源Ghrelin對(duì)綿羊卵母細(xì)胞成熟機(jī)制及作用提供了基礎(chǔ)，但詳細(xì)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Dimaraki E V，Jaffe C A.Role of endogenous ghrelin in growth hormone secretion，appetite regulation metabolism[J].Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders，2006，7（4）：237-249.

[2]Ghelardoni S，Carnicelli V，F(xiàn)rascarelli S，et al.Ghrelin tissue distribution：comparison between gene and protein expression[J].Journal of endocrinological investigation，2006，29（2）：115-121.

[3]Nandi S，Ravindranatha B M，Gupta P S P， et al.Timing of sequential changes in cumulus cells and first polar body extrusion during in vitro maturation of buffalo oocytes[J].Theriogenology，2002，57（3）：1151-1159.

[4]Zhang K，Wei Hx， Zhang Y H， et al.Effects of ghrelin on in vitro development of porcine in vitro fertilized and parthenogenetic embryos[J].Journal of Reproduction and Development，2007，53（3）：647-653.

[5]Dovolou E， Messinis I E， Periquesue E，et al.Ghrelin accelerates in vitro maturation of bovine oocytes[J].Reproduction in Domestic Animals，2014，49（4）：665-672.

[6]Wang Z，Lin P，Yu S.Effects of ghrelin on developmental competence and gene expression of in vitro fertilized ovine embryos[J].Theriogenology，2013，79（4）：695-701.

[7]Ruixia Bai.Effects of Ghrelin on the Ovine Oocytes During in vitro Maturation[D].Inner Mongolia Agricultural University，2011，45（1）：92-98.

[8]Wang Z，Linp，Yu S.Effects of ghrelin on developmental competence and gene expression of in vitro fertilized ovine embryos[J].Theriogenology，2013，79（4）：695-701.

[9]Gnanpavan S，Kolab，Bustin S A，et al.The tissue distribution of the mRNA of ghrelin and subtypes of its receptor，GHS-R，in humans[J].The journal of clinical endocrinology & metabolism，2002，87（6）：2988-2991.

[10]Tanaka K，MinourA H，Isobe T，et al.Ghrelin is involved in the decidualization of human endometrial stromal cells[J].The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism，2003，88（5）：2335-2340.

[11]Du C，Cao G，Wang C，et al.Expression of the orexigenic peptide ghrelin in the sheep ovary[J].Domestic animal endocrinology，2009，36（2）：89-98.

[12]Pesce，M Gross M K， Scholer H R. In line with our ancestors：Oct-4 and the mammalian germ[J].Bioessays，1998，20（9）：722-732.

[13]Zzccoyyi M，Merico V，Belli M， et al.Oct-4 and the acquisition of oocyte developmental competence during folliculogenesis[J].International Journal of Developmental Biology，2013，56（10-11-12）：853-858.

[14]Deng D，Xu C，Sun P，et al.Crystal structure of the human glucose transporter GLUT1[J].Nature，2014，510（7503）：121-125.

[15]Pantaleon M，Ryan J P，Gil M，et al.An unusual subcellular localization of GLUT1 and link with metabolism in oocytes and preimplantation mouse embryos[J].Biology of reproduction，2001，64（4）：1247-1254.

[16]Morita Y， TsutlmiO，Hosoya I，et al.Expression and possible function of glucose transporter protein GLUT1 during preimplantation mouse development from oocytes to blastocysts[J].Biochemical and biophysical research communications，1992，188（1）：8-15.

[17]Morita，Tsutlmi O，Hosoya I，et al.Expression and possible function of glucose transporter protein GLUT1 during preimplantation mouse development from oocytes to blastocysts[J].Biochemical and biophysical research communications，1992，188（1）：8-15.

[18]Han Y，Yan Y， Zhou J， et al.Acute fasting decreases the expression of GLUT1 and glucose utilisation involved in mouse oocyte maturation and cumulus cell expansion[J].Reproduction，F(xiàn)ertility and Development，2012，24（5）：733-742.

[19]Dhalia，Javvaji P K，Kolte A P，et al.Temporal expression of cumulus cell marker genes during in vitro maturation and oocyte developmental competence[J].Journal of assisted reproduction and genetics，2017，34（11）：1493-1500.

[20]Bazer F W，Thatche W W.Chronicling the discovery of interferon tau[J].Reproduction，2017，154（5）：F11-F20.

[21]Spencer T E， Bazer F W.Conceptus signals for establishment and maintenance of pregnancy[J].Reproductive Biology and Endocrinology，2004，2（1）：49-50

[22]Rajput S K，Lee K B， Zhenhua G，et al.Embryotropic actions of follistatin：paracrine and autocrine mediators of oocyte competence and embryo developmental progression[J].Reproduction，F(xiàn)ertility and Development，2014，26（1）：37-47.

（責(zé)編：張宏民）