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        人凝血因子Ⅸ效價(jià)測(cè)定影響因素的探討

        2018-07-09 10:58:22周仁花
        生物化工 2018年3期
        關(guān)鍵詞:標(biāo)準(zhǔn)

        周仁花

        (廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司,廣東廣州 515071)

        人凝血酶原復(fù)合物(PCC)是由健康人血漿,經(jīng)DEAE-sephadex A-50凝膠吸附純化,并經(jīng)病毒去除和滅活處理,凍干而成的血液制品,主要用于治療凝血因子Ⅸ缺乏癥(乙型血友?。Q邪l(fā)生產(chǎn)人凝血酶原復(fù)合物,是進(jìn)一步充分利用血漿資源的有效途徑之一。根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版[1],人凝血酶原復(fù)合物活性成分Ⅸ因子效價(jià)測(cè)定采用一期法,與英國(guó)藥典、歐洲藥典基本一致。筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn),總結(jié)了不同APTT試劑,不同稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)與樣品復(fù)溶后置-20 ℃以下凍存對(duì)Ⅸ因子效價(jià)測(cè)定的影響,結(jié)果報(bào)告如下。

        1 材料和方法

        1.1 主要試劑

        (1)人凝血因子Ⅱ、Ⅲ、Ⅸ、Ⅹ國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品20010620:中國(guó)生物制品檢定所。(2)咪唑緩沖液:Thermo公司,135 mL/瓶。(3)APTT試劑:APTTLS(中敏感度 激活劑為鞣花酸)、APTT-XL(高敏感度 激活劑為鞣花酸)、SynthAsil-液體APTT(人工合成磷脂 激活劑為超微細(xì)硅)。(4)人凝血因子Ⅸ缺乏血漿:Thermo公司,1 mL/瓶。(5)硫酸魚(yú)精蛋白:西格瑪公司Grade X。(6)人凝血酶原復(fù)合物樣品:300 IU/瓶,10 mL水復(fù)溶,廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司生產(chǎn)。

        1.2 儀器

        ACL7000全自動(dòng)凝血分析儀(美國(guó)IL公司)。

        1.3 方法

        《中國(guó)藥典》2015年版三部 通則3519中的人凝血因子Ⅸ效價(jià)測(cè)定法(一期法)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同APTT試劑對(duì)結(jié)果的影響

        當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線Ⅸ因子效價(jià)為0.1~0.006 25 IU/mL時(shí),分別使用APTT-LS、APTT-XL、SynthAsil-液體APTT測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品,APTT-LS測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)與最低點(diǎn)凝固時(shí)間差值較大;3種不同APTT試劑測(cè)同一批樣品結(jié)果均值無(wú)顯著性差異(P3>0.05),方差不全相等(P3<0.05)。數(shù)據(jù)見(jiàn)表 1、表 2。

        2.2 不同稀釋液對(duì)結(jié)果的影響

        兩種不同稀釋液分別是A液(儀器廠家配套供給的稀釋液,即咪唑緩沖液,使用0.025 mol/L氯化鈣溶液)、B液(中國(guó)藥典方法規(guī)定的稀釋液,即A液與3.8%枸櫞酸鈉按5∶1混合,加適量20%人血白蛋白至終濃度為1%,使用0.05mol/L氯化鈣溶液),分別稀釋標(biāo)準(zhǔn)和樣品,測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線凝固時(shí)間差值、樣品結(jié)果、方差均無(wú)顯著性差異(P3>0.05)。數(shù)據(jù)見(jiàn)表3、表4。

        表3 不同稀釋液標(biāo)準(zhǔn)曲線凝固時(shí)間

        表4 不同稀釋液測(cè)同一批樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        表1 不同APTT試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線凝固時(shí)間

        表2 不同APTT試劑測(cè)得的樣品結(jié)果

        2.3 標(biāo)準(zhǔn)復(fù)溶后凍存穩(wěn)定性

        取一支人凝血酶原復(fù)合物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品,按說(shuō)明書(shū)復(fù)溶后小體積(110 μL/支)分裝,置-20 ℃以下凍存,分別于0天(現(xiàn)溶現(xiàn)測(cè))、8天、10天、19天、35天取樣測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線凝固時(shí)間,考察穩(wěn)定性,結(jié)果見(jiàn)表5。8天、10天、19天、35天標(biāo)準(zhǔn)曲線與0天比較,無(wú)顯著性差異(P3>0.05),表明標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后置-20℃以下凍存35天對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。

        表5 不同貯存時(shí)間測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線截距、斜率

        2.4 樣品復(fù)溶后凍存穩(wěn)定性

        取一瓶人凝血酶原復(fù)合物,按說(shuō)明書(shū)復(fù)溶后小體積(1.5 mL/瓶)分裝,置-20 ℃以下凍存,分別于0天(現(xiàn)溶現(xiàn)測(cè))、8天、10天、19天、35天取樣測(cè)定人凝血因子Ⅸ效價(jià),考察穩(wěn)定性,結(jié)果見(jiàn)表6。8天、10天、19天、35天樣品結(jié)果與0天相比,差值均不超過(guò)10%,表明樣品復(fù)溶后置-20℃以下凍存35天對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。

        表6 不同貯存時(shí)間測(cè)得的樣品結(jié)果

        3 討論

        按瀑布學(xué)說(shuō),Ⅸ因子效價(jià)測(cè)定原理是一系列酶促反應(yīng),APTT試劑在反應(yīng)過(guò)程中提供催化表面與激活劑[2],因提供催化表面的磷脂來(lái)源不同,激活劑種類不同以及生產(chǎn)廠家不同,不同的APTT試劑對(duì)凝血因子的檢測(cè)敏感性是不同的。從表1、表2結(jié)果看,3種APTT試劑測(cè)定同一批質(zhì)控品,結(jié)果無(wú)顯著性差異,但使用APTT-LS試劑重復(fù)性優(yōu)于其他兩種試劑,建議購(gòu)買(mǎi)APTT試劑時(shí),選擇在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)高濃度與低濃度凝固時(shí)間差值較大的APTT。

        從表3、表4結(jié)果看,咪唑緩沖液中是否添加枸櫞酸鈉與白蛋白,兩者測(cè)得的結(jié)果一致,使用儀器廠家配套的稀釋液和氯化鈣溶液檢測(cè)Ⅸ因子效價(jià)也是可行的。

        從表5、表6結(jié)果看,將標(biāo)準(zhǔn)和樣品復(fù)溶后分裝,貯存于-20 ℃以下,35天后測(cè)定效價(jià)無(wú)明顯變化。因此可以將復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分裝后貯存于-20 ℃以下,臨用時(shí)再解凍,每次使用一支,35天內(nèi)使用有效。

        [1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.四部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015.

        [2]沈琦,云志宏,劉大英.人凝血酶原復(fù)合物(PCC)效價(jià)測(cè)定中幾種影響因素的探討[J].中國(guó)輸血雜志,1994,7(3):132-134.

        [3]孫振球,徐勇勇.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2014:23-42.

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