周仁花

（廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司，廣東廣州 515071）

人凝血酶原復(fù)合物（PCC）是由健康人血漿，經(jīng)DEAE-sephadex A-50凝膠吸附純化，并經(jīng)病毒去除和滅活處理，凍干而成的血液制品，主要用于治療凝血因子Ⅸ缺乏癥（乙型血友?。Ｑ邪l(fā)生產(chǎn)人凝血酶原復(fù)合物，是進(jìn)一步充分利用血漿資源的有效途徑之一。根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版[1]，人凝血酶原復(fù)合物活性成分Ⅸ因子效價(jià)測(cè)定采用一期法，與英國(guó)藥典、歐洲藥典基本一致。筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)，總結(jié)了不同APTT試劑，不同稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)與樣品復(fù)溶后置-20 ℃以下凍存對(duì)Ⅸ因子效價(jià)測(cè)定的影響，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

（1）人凝血因子Ⅱ、Ⅲ、Ⅸ、Ⅹ國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品20010620：中國(guó)生物制品檢定所。（2）咪唑緩沖液：Thermo公司，135 mL/瓶。（3）APTT試劑：APTTLS（中敏感度 激活劑為鞣花酸）、APTT-XL（高敏感度 激活劑為鞣花酸）、SynthAsil-液體APTT（人工合成磷脂 激活劑為超微細(xì)硅）。（4）人凝血因子Ⅸ缺乏血漿：Thermo公司，1 mL/瓶。（5）硫酸魚(yú)精蛋白：西格瑪公司Grade X。（6）人凝血酶原復(fù)合物樣品：300 IU/瓶，10 mL水復(fù)溶，廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器

ACL7000全自動(dòng)凝血分析儀（美國(guó)IL公司）。

1.3 方法

《中國(guó)藥典》2015年版三部 通則3519中的人凝血因子Ⅸ效價(jià)測(cè)定法（一期法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同APTT試劑對(duì)結(jié)果的影響

當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線Ⅸ因子效價(jià)為0.1～0.006 25 IU/mL時(shí)，分別使用APTT-LS、APTT-XL、SynthAsil-液體APTT測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品，APTT-LS測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)與最低點(diǎn)凝固時(shí)間差值較大；3種不同APTT試劑測(cè)同一批樣品結(jié)果均值無(wú)顯著性差異（P3＞0.05），方差不全相等（P3＜0.05）。數(shù)據(jù)見(jiàn)表 1、表 2。

2.2 不同稀釋液對(duì)結(jié)果的影響

兩種不同稀釋液分別是A液（儀器廠家配套供給的稀釋液，即咪唑緩沖液，使用0.025 mol/L氯化鈣溶液）、B液（中國(guó)藥典方法規(guī)定的稀釋液，即A液與3.8%枸櫞酸鈉按5∶1混合，加適量20%人血白蛋白至終濃度為1%，使用0.05mol/L氯化鈣溶液），分別稀釋標(biāo)準(zhǔn)和樣品，測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線凝固時(shí)間差值、樣品結(jié)果、方差均無(wú)顯著性差異（P3＞0.05）。數(shù)據(jù)見(jiàn)表3、表4。

表3 不同稀釋液標(biāo)準(zhǔn)曲線凝固時(shí)間

表4 不同稀釋液測(cè)同一批樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 不同APTT試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線凝固時(shí)間

表2 不同APTT試劑測(cè)得的樣品結(jié)果

2.3 標(biāo)準(zhǔn)復(fù)溶后凍存穩(wěn)定性

取一支人凝血酶原復(fù)合物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，按說(shuō)明書(shū)復(fù)溶后小體積（110 μL/支）分裝，置-20 ℃以下凍存，分別于0天（現(xiàn)溶現(xiàn)測(cè)）、8天、10天、19天、35天取樣測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線凝固時(shí)間，考察穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表5。8天、10天、19天、35天標(biāo)準(zhǔn)曲線與0天比較，無(wú)顯著性差異（P3＞0.05），表明標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后置-20℃以下凍存35天對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。

表5 不同貯存時(shí)間測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線截距、斜率

2.4 樣品復(fù)溶后凍存穩(wěn)定性

取一瓶人凝血酶原復(fù)合物，按說(shuō)明書(shū)復(fù)溶后小體積（1.5 mL/瓶）分裝，置-20 ℃以下凍存，分別于0天（現(xiàn)溶現(xiàn)測(cè)）、8天、10天、19天、35天取樣測(cè)定人凝血因子Ⅸ效價(jià)，考察穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表6。8天、10天、19天、35天樣品結(jié)果與0天相比，差值均不超過(guò)10%，表明樣品復(fù)溶后置-20℃以下凍存35天對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。

表6 不同貯存時(shí)間測(cè)得的樣品結(jié)果

3 討論

按瀑布學(xué)說(shuō)，Ⅸ因子效價(jià)測(cè)定原理是一系列酶促反應(yīng)，APTT試劑在反應(yīng)過(guò)程中提供催化表面與激活劑[2]，因提供催化表面的磷脂來(lái)源不同，激活劑種類不同以及生產(chǎn)廠家不同，不同的APTT試劑對(duì)凝血因子的檢測(cè)敏感性是不同的。從表1、表2結(jié)果看，3種APTT試劑測(cè)定同一批質(zhì)控品，結(jié)果無(wú)顯著性差異，但使用APTT-LS試劑重復(fù)性優(yōu)于其他兩種試劑，建議購(gòu)買(mǎi)APTT試劑時(shí)，選擇在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)高濃度與低濃度凝固時(shí)間差值較大的APTT。

從表3、表4結(jié)果看，咪唑緩沖液中是否添加枸櫞酸鈉與白蛋白，兩者測(cè)得的結(jié)果一致，使用儀器廠家配套的稀釋液和氯化鈣溶液檢測(cè)Ⅸ因子效價(jià)也是可行的。

從表5、表6結(jié)果看，將標(biāo)準(zhǔn)和樣品復(fù)溶后分裝，貯存于-20 ℃以下，35天后測(cè)定效價(jià)無(wú)明顯變化。因此可以將復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分裝后貯存于-20 ℃以下，臨用時(shí)再解凍，每次使用一支，35天內(nèi)使用有效。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.四部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015.

[2]沈琦,云志宏,劉大英.人凝血酶原復(fù)合物(PCC)效價(jià)測(cè)定中幾種影響因素的探討[J].中國(guó)輸血雜志,1994,7(3):132-134.

[3]孫振球，徐勇勇.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014:23-42.