管紅玲，陳繼鋒，周仁花

（廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司，廣東汕頭 515000）

激肽釋放酶原激活劑（prekallikrein activator，簡(jiǎn)稱PKA）是血漿中凝血因子XII被表面激活而釋放出的激肽釋放酶限制性蛋白酶，主要含α因子XIIa及β-XIIa肽段，是一種水解蛋白[1]。PKA能激活激肽釋放酶原（PK）使其轉(zhuǎn)變?yōu)榧る尼尫琶窴后水解了高分子激肽原（HMWK），并釋放出具有生物活性的激肽（BK）。BK具有導(dǎo)致局部疼痛，引起水泡、呼吸加速，尤其突出的臨床反應(yīng)是具有舒緩、擴(kuò)張血管降低血壓的作用[1]。人血白蛋白的臨床主要應(yīng)用于嚴(yán)重失血性創(chuàng)傷及燒傷所引起的低血容量休克，治療腎病或白蛋白缺乏所引起的水腫等。當(dāng)人血白蛋白中的PKA含量過高時(shí)或不合格，會(huì)在輸注時(shí)出現(xiàn)血壓下降的不良反應(yīng)[2]。所以PKA是血液制品生產(chǎn)工藝中必須控制的質(zhì)量指標(biāo)，以確?；颊叩挠盟幇踩?，《中國(guó)藥典》人血白蛋白的PKA控制標(biāo)準(zhǔn)≤35IU/mL[3]。

PKA的產(chǎn)生是開始采集血漿時(shí)啟動(dòng)，凝血反應(yīng)也隨即產(chǎn)生，而添加的枸椽酸鈉抗凝劑未跟血液充分混勻，使用的器具未硅化等，人血漿在冷鏈運(yùn)輸、貯存溫度不當(dāng)引起反復(fù)凍融、以及在生產(chǎn)控制過程過于追求產(chǎn)量而雜質(zhì)高都將提高PKA水平[4]。本文設(shè)計(jì)了PKA對(duì)熱敏感性研究，并將3組樣品分別放置在2～8℃、20～25℃、29～31 ℃條件下貯存，以研究不同貯存溫度對(duì)PKA的影響，為人血白蛋白控制PKA含量設(shè)計(jì)工藝研發(fā)路線、設(shè)計(jì)產(chǎn)品貯存條件及運(yùn)輸溫度提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)儀器和材料

1.1 樣品加溫、檢測(cè)設(shè)備

1.1.1 恒溫水浴鍋

型號(hào)：CS501-3C；溫度范圍：R.T +5～95℃；溫度波動(dòng)度：±0.5℃；廠家：北京衛(wèi)星制造廠；要求：應(yīng)對(duì)恒溫水浴鍋進(jìn)行校準(zhǔn)，溫度波動(dòng)度在±0.5℃范圍內(nèi)，在校準(zhǔn)有效期內(nèi)使用；用途：對(duì)樣品進(jìn)行62℃、2h，63℃、2.5h的恒溫。

1.1.2 酶標(biāo)儀

型號(hào)：ELx800；精度范圍：分辨率為0.001 OD，線性≥0.99，OD重復(fù)性為±0.005 OD（即≤0.010 OD），OD準(zhǔn)確性為±0.010 OD（即≤0.020 OD），波長(zhǎng)范圍為400～750 nm，動(dòng)態(tài)范圍0～3.0 OD；廠家：美國(guó)伯騰儀器有限公司；要求：應(yīng)對(duì)酶標(biāo)儀進(jìn)行校準(zhǔn)，在校準(zhǔn)的有效期內(nèi)使用；用途：檢測(cè)血液制品的激肽釋放酶原激活劑PKA含量。

1.1.3 二等標(biāo)準(zhǔn)水銀溫度計(jì)

測(cè)量范圍：-30～20℃；精密度：0.1℃；廠家：常州雙環(huán)熱工儀表有限公司。

1.2 檢測(cè)試劑

激肽釋放酶原激活劑（PKA）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所），前激肽釋放酶（PK）試劑（成都協(xié)和生物技術(shù)中心），激肽釋放酶顯色底物（S-2302）。

1.3 檢測(cè)方法

采用顯色底物法（或顯色基質(zhì)法）測(cè)定[3]。

1.4 樣品要求

本次研究的樣品是由廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司生產(chǎn)，是以合格的單人份血漿為原料，采取經(jīng)典的Cohn低溫乙醇法中提取人血白蛋白，通過超濾脫醇、添加辛酸鈉保護(hù)劑配制成為20%（10g）蛋白質(zhì)溶液，通過60℃、10h及除菌灌裝在50mL玻璃瓶中再經(jīng)29.5～30.5℃孵育14天即為研究樣品。

1.5 恒溫室要求

1.5.1 三星冰箱

溫度控制：2～8℃；設(shè)置溫度：5℃，上限設(shè)置為7℃，下限設(shè)置為3℃。

1.5.2 藥品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱（2個(gè)）

設(shè)備型號(hào)為L(zhǎng)HH-150SD，溫度偏差≤±1.0℃，濕度偏差≤±3.0%，溫度均勻度≤1.0℃，濕度均勻度≤5.0%。

2 方法

2.1 方法設(shè)計(jì)

廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司人血白蛋白貯存溫度2～30℃，有效期3年。故本次研究將人血白蛋白完成從原料血漿投料至超濾脫醇后配制成半成品，經(jīng)60℃、10h巴氏滅活開始設(shè)計(jì)PKA對(duì)熱敏感研究方案，分別設(shè)計(jì)了2～8℃、20～25℃、29～31℃貯存條件。本次設(shè)計(jì)了A、B、C三組樣品考察，2～8℃樣品放置在冰箱，20～25℃、29～31℃樣品放置在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱，分別考察36個(gè)月。

2.1.1 A組

取3批人血白蛋白在完成60℃、0h巴氏滅活前（A1樣品）、60℃、10h巴氏滅活后（A2樣品），產(chǎn)品除菌灌裝（A3樣品）并經(jīng)29.5～30.5℃孵育14天為0月計(jì)分別取樣檢測(cè)PKA含量，將3批樣品放置在2～8℃中，并分別于3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月和36個(gè)月取出樣品檢測(cè)PKA含量，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.1.2 B組

取3批人血白蛋白在完成60℃、10h巴氏滅活前（B1-1/B2-1）、60℃、10h巴氏滅活后（B1-2/B2-2），除菌灌裝后（B1-3/B2-3）并經(jīng)29.5～30.5℃孵育14天為0月計(jì)分別取樣檢測(cè)PKA含量，將3批樣品放置在20～25℃（B1）、29～31℃（B2）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱中，并分別于3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月和36個(gè)月取出樣品檢測(cè)PKA含量，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.1.3 C組

取3批人血白蛋白在完成60℃、10h巴氏滅活（C1-1/C2-1樣品），除菌灌裝后（C2組）取樣品放置在CS501-3C恒溫水浴鍋62℃恒溫2h[4]（C1-2/C2-2樣品），經(jīng)29.5～30.5℃孵育14天計(jì)為0月（C1-3/C2-3樣品）。分別取樣檢測(cè)PKA含量，將3批樣品經(jīng)放置20～25℃（C1樣品）、29～31℃（C2樣品）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)箱中，并分別于3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月和36個(gè)月取出樣品檢測(cè)PKA含量，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 PKA檢測(cè)方法

采用顯色底物法，用紫外-可見分光光度法在波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定供試品吸光度，計(jì)算PKA含量[3]。

3 結(jié)果與分析

3.1 A組結(jié)果

A組設(shè)計(jì)方案從表1可見，人血白蛋白在經(jīng)60℃、10h巴氏滅活后較滅活前的PKA值平均下降了43.5%，但經(jīng)29.5～30.5℃孵育14天后較滅活后PKA值平均回升50%，在2～8℃貯存36個(gè)月考察期間，PKA控制值出現(xiàn)緩慢上升又下降趨勢(shì)，但均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)≤35IU/mL，結(jié)果表明60℃、10h巴氏滅活及貯存溫度、時(shí)間對(duì)控制PKA是一定有影響。

從A組結(jié)果中可見人血白蛋白在經(jīng)60℃、10h巴氏滅活后較滅活前、以及在經(jīng)29.5～30.5℃14天孵育后較滅活后的PKA值控制值有下降及回升的過程。

3.2 B1、B2組方法結(jié)果

3.2.1 B1組結(jié)果

將樣品放置在20～25℃貯存考察36個(gè)月按表2取樣周期分別檢測(cè)PKA值，可見PKA控制值出現(xiàn)緩慢上升又下降趨勢(shì)（見圖1），分水嶺在3個(gè)月開始逐漸下降，并均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)≤35IU/mL，結(jié)果表明60℃10h巴氏滅活、提高貯存溫度可降低PKA值。

圖1 B1組方案人血白蛋白PKA結(jié)果（貯存條件20～25℃）

3.2.2 B2組結(jié)果

將樣品放置在29～31℃貯存36個(gè)月考察期間按表3取樣檢測(cè)PKA值，出現(xiàn)PKA控制值緩慢上升又下降趨勢(shì)(見圖2)，分水嶺在3個(gè)月開始逐漸下降，并均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)≤35IU/mL，結(jié)果表明60℃、10h巴氏滅活、提高一定的貯存溫度可降低PKA值。

圖2 B2組方案人血白蛋白PKA結(jié)果（貯存條件29～31℃）

表1 A組方案人血白蛋白PKA結(jié)果（貯存條件2～8℃）(單位：IU/mL)

表2 B1組方案人血白蛋白PKA結(jié)果（貯存條件20～25℃）(單位：IU/mL)

表3 B2組方案人血白蛋白PKA結(jié)果（貯存條件29～31℃）(單位：IU/mL)）

3.3 C1組、C2組方法結(jié)果

3.3.1 C1組方法結(jié)果

從表4、圖4可見，人血白蛋白在經(jīng)60℃、10h巴氏滅活繼續(xù)進(jìn)行62℃、2h較滅活前的PKA值平均下降了82.6%，但經(jīng)29.5～30.5℃孵育14天后較滅活后PKA值平均回升150%，樣品放置在20～25℃貯存36個(gè)月考察期間按表4取樣檢測(cè)PKA，發(fā)現(xiàn)PKA同樣出現(xiàn)緩慢上升又下降趨勢(shì)見圖3，并在3個(gè)月開始逐漸下降，并均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)≤35IU/mL，結(jié)果表明提高巴氏滅活溫度、延長(zhǎng)滅活時(shí)間、提高貯存溫度可明顯降低PKA含量。

圖3 C1組方案人血白蛋白PKA結(jié)果

圖4 C組方案人血白蛋白PKA結(jié)果（貯存條件29～31 ℃）

表4 C1組方案人血白蛋白PKA結(jié)果（60℃10h+62℃2h貯存條件20～25℃）(單位：IU/mL)

表5 C2組方案人血白蛋白PKA結(jié)果（60℃10h+62℃2h貯存條件29～31℃）(單位：IU/mL)

3.3.2 C2組方法結(jié)果

從C1級(jí)方案可見人血白蛋白在經(jīng)60℃10h巴氏滅活繼續(xù)62℃2h較滅活前、經(jīng)29.5～30.5℃孵育14天后較滅活后的PKA值有大幅度的下降及回升趨勢(shì)，樣品放置在29～31℃貯存36個(gè)月考察期間按表5取樣檢測(cè)PKA值，PKA控制值同樣出現(xiàn)緩慢上升及下降趨勢(shì)（見圖4），并在3個(gè)月開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，并均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)≤35IU/mL，結(jié)果表明在同等巴氏滅活條件下、延長(zhǎng)滅活時(shí)間、提高一定貯存溫度可明顯降低PKA含量。

4 討論

A組、B組研究結(jié)果表明血漿中的PKA在經(jīng)過60℃高溫后平均可以滅活43.5%PKA，但進(jìn)行29.5～30.5℃孵育14天工序后PKA水平較巴氏滅活后增加了50%。C組結(jié)果表明當(dāng)60℃10h巴氏滅活再繼續(xù)62℃2h加溫后PKA含量較A組、B組平均下降60%水平，但同樣進(jìn)行29.5～30.5℃孵育14天工序后PKA水平較巴氏滅活后增加了150%。陳通威等報(bào)道[4]，PKA對(duì)熱非常穩(wěn)定，60℃或提高溫度或時(shí)間無(wú)法有效滅活PKA。

通過對(duì)人血白蛋白36個(gè)月PKA水平的考察發(fā)現(xiàn)，A組在2～8℃貯存過程中PKA含量在逐漸上升直至30個(gè)月后，PKA方有下降趨勢(shì)，證實(shí)了Suontaka 等[5]報(bào)道，輸血用血漿在4℃保存期間發(fā)生冷激活，在冷激活中激肽釋放酶樣活性增加。B1組、B2組分別在20～25℃、29～31℃貯存過程中PKA含量3個(gè)月內(nèi)在逐漸上升，3～9個(gè)月有一個(gè)水平平穩(wěn)過程后又逐漸下降。C1組、C2組的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。也就是說通過高溫后的PKA未能有效滅活，但產(chǎn)品貯存在20～30℃激肽釋放酶的活性在降低。從考察結(jié)果來(lái)看，B組與C組PKA水平實(shí)際上無(wú)明顯差異。

控制血漿中PKA水平應(yīng)該從原料血漿的采集、嚴(yán)格控制運(yùn)輸及貯存溫度、控制好生產(chǎn)過程反應(yīng)溫度及PH值，也可采取硅藻土吸附的方法[6]。采取巴氏滅活、提高巴氏滅活溫度或延長(zhǎng)時(shí)間的方法來(lái)降低PKA水平，會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和純度有一定的影響[7]。

綜上所述，人血白蛋白中PKA選擇適宜的貯存溫度可降低未能滅活的PKA含量，本次研究為衛(wèi)倫生物制藥有限公司制定控制PKA生產(chǎn)工藝路線、設(shè)計(jì)原料血漿及產(chǎn)品運(yùn)輸、貯存溫度，提高產(chǎn)品質(zhì)量的目的具有很大的意義。

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