李旭,徐威,于海,陳志成
(1.沈陽藥科大學,遼寧沈陽 110016;2.遼寧成大生物股份有限公司,遼寧沈陽 110179)
Vero細胞是世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦制備疫苗的常用細胞基質(zhì),用于疫苗生產(chǎn)能克服原代細胞疫苗的很多缺點,已經(jīng)成功地應用于狂犬病疫苗、乙腦疫苗、流感疫苗、EV71疫苗等的生產(chǎn)中。由于Vero細胞是來源動物組織的傳代細胞,用其生產(chǎn)疫苗的原液中含有少量Vero細胞膜蛋白和結構蛋白[1],這些細胞蛋白會對人體健康可能產(chǎn)生潛在影響,《中國藥典》三部(2015版)中對宿主蛋白雜質(zhì)含量有嚴格規(guī)定,要求乙腦疫苗成品宿主蛋白殘留量小于2 μg/mL[2]。目前,在疫苗制備過程中通常使用Sepharose系列凝膠,利用病毒與雜質(zhì)分子量不同的特點,使用分子篩原理純化病毒。
新型凝膠Capto Core700是一種復合模式介質(zhì)(如圖1所示),以核心微球技術為基礎,介質(zhì)表面是5 μm厚度的凝膠層,空間間隙為相對分子質(zhì)量(Mr)約700 000的孔環(huán)繞成的球體,球體內(nèi)部為帶有鋅氨基配基的正電荷分子。在純化過程中,相對分子量小于700 000的生物分子將進入孔內(nèi),帶負電的雜質(zhì)會被其吸附,利用病毒分子從外水體積通過,雜質(zhì)被介質(zhì)吸附的方法,達到去除雜質(zhì)的目的[3]。本實驗應用CaptoCore700復合介質(zhì)使乙腦病毒分子經(jīng)過凝膠表面流過,宿主蛋白等小分子雜質(zhì)被凝膠內(nèi)正電荷基團吸附,達到分離效果[4]。
圖1 CaptoCore結構
P3株乙腦病毒,源自北京生檢所;Vero細胞,源自美國ATCC/WHO。
復合凝膠CaptoCore700和AKTA avant150層析系統(tǒng),購自美國GE公司;Vero細胞宿主蛋白檢測試劑盒,購自北京天壇生物制品股份有限公司;5 L的celligen plus 生物反應器,購自美國NBS公司;微載體,購自美國GE公司;0.8μm孔徑濾芯,購自賽多利斯公司;300kD的膜包,購自密理博公司;β-丙內(nèi)酯,購自Sigma公司。
Vero細胞接種至微載體,在Celligen plus生物反應器中于37 ℃培養(yǎng)6天;長滿微載體表面,降溫至33 ℃,按MOI 1:500的比例接種P3株乙腦病毒,感染2 h;灌流病毒維持液48h;收獲病毒,至微載體上細胞匯合率為15%時停止收獲。連續(xù)制備10批,批號為J1701~J1710。
將病毒原液經(jīng)0.8 μm孔徑濾芯澄清,再經(jīng)過300 kD的膜包濃縮約20倍,獲得病毒濃縮液;病毒濃縮液加入1/4 000體積的β-丙內(nèi)酯,于2~8 ℃件下滅活病毒24 h,獲得病毒滅活液。
將裝載復合凝膠CaptoCore700的純化柱用緩沖液(10 mmol/L PBS,pH 7.3~7.4)平衡40個柱體積。上樣病毒滅活液,上樣體積控制在3個柱體積,流速75 cm/h,收集紫外吸收峰,用CIP 清洗液(1.0 mol/L NaOH)清洗純化系統(tǒng),進行凝膠再生。
1.6.1 乙腦宿主蛋白含量檢測
使用北京天壇生物制品有限公司Vero細胞殘余蛋白檢測試劑盒檢測,方法:將樣品適當稀釋加至酶標板37 ℃孵育1 h洗滌,再加入酶標記物及底物液反應,酶標儀在450 nm測定吸光值與標準抗原連續(xù)稀釋后繪制標準曲線比對計算結果。
1.6.2 乙腦滅活液、純化液抗原含量檢測
使用乙型腦炎病毒ELISA實驗檢測,方法:將樣品適當稀釋后加入預先包被好抗體的酶標板中37 ℃孵育90 min后清洗,再加入乙腦病毒糖蛋白單抗,之后加酶標記結合物后再次孵育、顯色,用酶標儀在波長492 nm測定OD值計算樣品稀釋倍數(shù)。
裝載Sepharose 6FF凝膠的純化柱用緩沖液平衡1.5個柱體積,將病毒滅活液加載到純化介質(zhì),上樣體積控制在15%個柱體積,流速20 cm/h,收集紫外吸收峰。
10批病毒滅活液經(jīng)復合凝膠Capto Core700純化后,清晰可見紫外吸收第一峰及第二峰,分別為目標峰和雜質(zhì)峰,表明該介質(zhì)可有效將疫苗原液中的雜質(zhì)分離,見圖2。
2.2.1 Vero細胞宿主蛋白去除率
純化后10批疫苗純化液的宿主細胞蛋白去除率為64.48%~70.35%,平均值為67.30%,標準偏差(SD)為1.87%,平均值±3SD的范圍為61.68%~72.92%,去除率均在此置信區(qū)間內(nèi),見表1。
表1 疫苗純化液的宿主細胞蛋白去除率
圖2 十批乙腦病毒液經(jīng)CaptoCore700凝膠層析圖譜
比較Sepharose與CaptoCore700在宿主蛋白去除方面的效果,見表2。由表2可知,P>0.05,說明兩種填料在宿主蛋白去除方面沒有顯著差異,宿主蛋白去除率基本一致。
2.2.2 乙腦病毒抗原回收率
純化后10批疫苗純化液的抗原含量的降幅見表3。比較Sepharose與CaptoCore700在抗原損失方面的效果,見表4。
由于P<0.05,說明兩種填料在抗原損失方面有顯著差異,CaptoCore700相對于Sepharose,抗原損失更小,收率更高。
表2 Sepharose6FF凝膠與CaptoCore700凝膠純化后的宿主細胞蛋白去除率
表3 疫苗純化液的抗原含量的降幅
表4 Sepharose6FF凝膠與CaptoCore700凝膠純化后抗原損失
乙型腦炎是亞洲許多國家的一種嚴重傳染病,近年來發(fā)病率達0.09~0.1/10萬,病死率為5%~35%。與其他傳染病相比,乙腦的發(fā)病率雖然不高,但其患病后的后果特別嚴重。在中國夏、秋兩季氣溫高、多雨潮濕容易滋生蚊蠅,是乙腦主要的流行季節(jié),南方地區(qū)通常為6~9月,北方地區(qū)通常為7~9月。中國CDC統(tǒng)計,2012和2013兩年內(nèi)乙型腦炎發(fā)病數(shù)分別為1 767例和2 121例,其中死亡數(shù)為58例和63例,位列所有傳染病死亡人數(shù)第8位。對乙腦的預防措施主要有防蚊滅蚊以及人群的疫苗免疫接種兩種手段,其中接種乙腦疫苗是最重要的措施[5]。
乙腦病毒呈球狀,直徑35~50nm,衣殼呈20面立體結構[6]。外有包膜,基因組為單股正鏈RNA。乙腦病毒分為5種基因型,分別是1型、2型、3型、4型和5型?;蚪M編碼10種蛋白,包括3個結構蛋白基因(衣殼蛋白C、膜前蛋白PrM和囊膜蛋白E)和7個非結構蛋白基因(糖蛋白NS1和NS2a,蛋白酶協(xié)調(diào)因子NS2b,蛋白酶和螺旋酶NS3、NS4a和NS4b以及RNA聚合酶NS5)[7]。
其中囊膜蛋白E(簡稱JEV E蛋白)具有血凝活性和中和活性,是病毒表面最重要的成分,它與病毒的吸附、穿入、致病和誘導宿主的免疫應答等作用緊密相關。乙腦疫苗的效價主要取決于JEV E蛋白的含量和空間構象。在疫苗生產(chǎn)中,乙腦病毒在細胞中復制、組裝過程中會產(chǎn)生一些游離的小分子JEV E蛋白,這些小分子由于未結合在完整病毒顆粒上,其免疫原性低。在純化過程中,去除游離的小分子JEV E蛋白顆??商岣咭呙缧r。
本實驗采用Capto Core700凝膠純化滅活液,抗原含量損失更小,收率更高。CaptoCore700復合凝膠對10批滅活液純化的宿主蛋白去除率為64.48%~70.35%,與傳統(tǒng)Sepharose系列凝膠純化宿主蛋白去除率64.50%~73.40%相比基本一致。但利用Capto Core700凝膠可將純化滅活液的上樣體積由15%柱體積提高至300%柱體積。
由于CaptoCore的結構特點,純化過程中分子量較小的組分很容易進入膠粒中心區(qū)被帶電基團吸附,所以理論上相對分子質(zhì)量(Mr)小于700 000且?guī)в胸撾姾傻牡碾s質(zhì)成份如宿主細胞DNA小分子、牛血清白蛋白及細菌內(nèi)毒素更易被分離,但由于本實驗時間有限不能對其他雜質(zhì)去除進行逐項檢測,本課題組將在今后做進一步研究。
綜上所述,CaptoCore700凝膠具有上樣量高、處理量大、縮短了工藝時間;保留抗原同時有效去除了宿主蛋白雜質(zhì)。
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