單小娥，張發(fā)宇，余金衛(wèi)，汪家權(quán)

（合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽合肥 230000）

螺旋藻（Spirulina Sp.）是近年來已經(jīng)規(guī)?；囵B(yǎng)的單細(xì)胞螺旋絲狀藍(lán)藻，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)60%～70%。由于螺旋藻營養(yǎng)豐富，并且富含多種藥物特性，引起了人們的廣泛關(guān)注[1]。鈍頂螺旋藻（Spirulinaplatesis）是螺旋藻中營養(yǎng)成分最高的一類，具有高蛋白、低脂肪、多種維生素的特點(diǎn)，其中的藻膽蛋白是一種天然食用色素，能夠提高淋巴細(xì)胞的活性，增強(qiáng)人體免疫力[2]，因此常被用來作蛋白提取的材料。

別藻藍(lán)蛋白（APC）是藻膽蛋白的一種，在科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)、工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。事實(shí)證明，APC作為熒光探針優(yōu)于其他的藻膽蛋白，因?yàn)锳PC的最大激發(fā)峰和發(fā)射峰位于紅光區(qū)，而大多數(shù)的生物材料在紅光區(qū)無發(fā)射峰，這樣就避免了相互之間的干擾[3]。同時(shí)，APC還可以作為食品中的色素添加劑以及醫(yī)學(xué)中的光敏劑和抗腫瘤物質(zhì)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，APC對(duì)腸病毒71感染猴腎細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞病理反應(yīng)具有明顯抑制作用[5]。

APC純化的方法通常涉及凝膠過濾色譜和離子交換層析的組合，但耗時(shí)，并且不適于分離大量的材料[6-7]，離子交換層析使用離子強(qiáng)度梯度洗脫也會(huì)帶來高離子強(qiáng)度的問題。羥基磷灰石可以高效提取高純度APC，由于APC和CPC的表面電荷性質(zhì)不同，它們與羥基磷灰石結(jié)合的能力也不同。在適當(dāng)?shù)木彌_液中，羥基磷灰石選擇性地僅吸附APC而不吸附CPC[8-9]。

本文采用硫酸銨分級(jí)粗提純結(jié)合羥基磷灰石柱層析法從鈍頂螺旋藻粉中分離純化出APC，并對(duì)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇，建立了一個(gè)快速、高效的純化APC的方法，并對(duì)純化液進(jìn)行紫外-可見吸收光譜掃描，運(yùn)用光譜學(xué)的基本原理分析了該純化工藝方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鈍頂螺旋藻粉，用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液溶解至含水率約為96.5%。

1.2 儀器與試劑

儀器：紫外-可見分光光度儀、低溫高速離心機(jī)、恒溫磁力攪拌器、電子天平、冷柜、QuickSep中高壓層析系統(tǒng)、Vantage-L層析柱。

試劑：硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、CHT-B型羥基磷灰石。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）藻膽蛋白的粗提。反復(fù)凍融3次后過4層普通20目紗布，離心得到藻膽蛋白粗提液。

（2）藻膽蛋白的硫酸銨分級(jí)純化。向粗提的藻膽蛋白中加入濃度為A（1.2～2.0 mol/L）的硫酸銨，在磁力攪拌器上勻速攪拌15min后離心（4℃，8000r/min，10min）取上清。再在上清中加入硫酸銨至濃度為B（1.8～2.6mol/L），勻速攪拌15min后離心取沉淀。沉淀用磷酸鹽緩沖溶液溶解待用。

（3）羥基磷灰石柱層析。樣品先用0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液透析過夜。上樣后用100、200mmol/L含0.1mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液梯度洗脫，流速6mL/min。將APC純度大于3部分的洗脫液合并透析過夜后再進(jìn)行一次柱層析。

（4）APC得率和純度測定方法[10]。APC濃度=(A650-0.19×A620)/5.65；APC純度=A650/A280；純化系數(shù)=A650/A620。式中：A620、A650分別代表藻藍(lán)蛋白溶液在620、650 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨分級(jí)粗提純條件的優(yōu)化

一步鹽析濃度選擇1.2、1.4、1.6、1.8mol/L和2.0mol/L，共5組，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。由于一步鹽析在1.2～2.0 mol/L濃度下的純度差別不大，故采用純化系數(shù)和回收率作為篩選條件。由圖1可知，隨著一步鹽析濃度的增加，回收率不斷降低，純化系數(shù)先降低后不斷上升。一步鹽析在1.6 mol/L時(shí)APC對(duì)PC的含量比發(fā)生較大轉(zhuǎn)變，說明溶液中APC對(duì)PC的所占比例要高，故選取1.6 mol/L為一步鹽析最佳投加點(diǎn)。

二步鹽析濃度選擇1.8、2.0、2.2、2.4mol/L和2.6mol/L，共5組，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。隨著硫酸銨濃度的增加純度先升后降，回收率不斷上升。二步鹽析在2.2 mol/L后APC純度發(fā)生陡降，而回收率趨勢平緩，故選取2.2 mol/L作為二步鹽析最佳濃度。

圖1 不同一步鹽析濃度下APC的純化系數(shù)和回收率

圖2 不同二步鹽析濃度下APC的純度和回收率

2.2 羥基磷灰石柱層析分離

圖3為第二次羥基磷灰石柱層析分級(jí)梯度洗脫曲線。由圖可知，洗脫峰為目標(biāo)組分APC，穿過組分為少量藻藍(lán)蛋白和其他雜蛋白[11]。純化后的APC純度達(dá)到4.64，回收率高達(dá)11.25%。

圖3 二步羥基磷灰石柱層析分級(jí)梯度洗脫曲線

2.3 不同工藝階段純化結(jié)果比較

綜合四步工藝觀察APC純化過程變化的具體情況見表1。如表1所示，經(jīng)四步工藝后，APC的純度由初始的0.32上升至4.64，達(dá)到試劑級(jí)的要求。

表1 不同階段APC的相關(guān)指標(biāo)

2.4 光譜分析

對(duì)不同純化工藝階段后的組分進(jìn)行200～700 nm全波長掃描，得到完整的光譜掃描圖如圖4。

因蛋白質(zhì)中的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使得蛋白質(zhì)具有紫外吸收的性質(zhì)，其吸收峰約在280nm處[12]，但一步鹽析后的上清液中含有大量的核酸類物質(zhì)，而核酸物質(zhì)的最大吸收峰在260nm處[13]，因此該段吸收峰藍(lán)移至265nm。

圖4 不同階段的溶液紫外-可見吸收光譜圖

綜合四步純化工藝光譜圖看，APC溶液在250～300nm吸收譜帶中，吸收峰逐步從258 nm移至280nm。在500～700nm處吸收譜帶中，吸收峰逐步從620nm移至652nm，最終顯示出APC的典型吸收峰特性。

3 結(jié)論

運(yùn)用兩步鹽析粗提純結(jié)合兩次羥基磷灰石層析的工藝能高效純化APC。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用1.6、2.2mol/L硫酸銨分級(jí)粗提純效果最佳，兩步鹽析后純度由0.34上升到1.24。兩次羥基磷灰石過柱后純度達(dá)到4.64，回收率高達(dá)11.25%。采用同一種填料兩次過柱，無需更換填料和洗脫條件，減少填料成本，操作簡單，高效省時(shí)。

運(yùn)用紫外-可見吸收光譜法分析各階段目標(biāo)產(chǎn)物，可清晰反映目標(biāo)APC的純化過程及去除雜質(zhì)情況。分離出的APC在分別在277nm和652nm有兩個(gè)明顯吸收峰，顯示出APC的典型吸收峰特性。

[1]Eriksen N T. Production of Phycocyanin-a Pigment with Applications in Biology, Biotechnology, Foods and Medicine[J]. Applied Microbiology&Biotechnology,2008,80(1):1-14.

[2]李冰,張學(xué)成,高美華,等.鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白提取純化新工藝[J].海洋科學(xué),2007,31(8):48-52.

[3]Bermejo R, Talavera E M, Alvarez-Pez J, et al. Chromatographic Purification of Biliproteins from Spirulinaplatensis, high-performance Liquid Chromatographic Separation of their α and β subunits[J].Journal of Chromatography A,1997,778(1-2):441-450.

[4]Shih S R, Tsai K N, Li Y S, et al. Inhibition of Enterovirus71-induced Apoptosis by Allophycocyanin Isolated from a Blue-green Alga SpirulinaPlatensis[J]. Journal of Medical Virology,2003,70(1):119-125.

[5]Chen T, Wong Y S, Zheng W. Purification and Characterization of Selenium-Containing Phycocyaninfrom Selenium-enriched SpirulinaPlatensis[J]. Phytochemistry,2006,67(22):2424.

[6]Su H N, Xie B B, Chen X L, et al. Efficient Separation and Purification of Allophycocyaninfrom Spirulina, ( Arthrospira ) Platensis[J]. Journal of Applied Phycology,2010,22(1):65-70.

[7]Soni B, Trivedi U, Madamwar D. A Novel Method of Single Step Hydrophobic Interaction Chromatography for the Purification of Phycocyaninfrom PhormidiumFragile, and its Characterization for Antioxidant Property[J]. Bioresour Technol,2008,99(1):188-194.

[8]Bennett A, Bogorad L. Complementary Chromatic Adaptation in a Filamentous Blue-Green Alga[J].Journal of Cell Biology,1973,58(2):419-435.

[9]Bryant D A, Guglielmi G, Marsac N T D, et al. The Structure of CyanobacterialPhycobilisomes: a Model[J].Archives of Microbiolo gy,1979,123(2):113-127.

[10]朱元榮,吳豐昌,林櫻.紫外吸收光譜積分法分析蛋白質(zhì)濃度－以堿性磷酸酶為例[J].光譜學(xué)與光譜分析,2013,33(7):1845-1849.

[11]呂憲禹.蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)方案與應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

[12]張靜,韋玉春,王國祥,等.太湖水體中藻藍(lán)蛋白的紫外-可見吸收光譜特征分析[J].光譜學(xué)與光譜分析,2014,34(5):1297-1301.