周廣洲 陳 俊 靳 峰

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧 272067；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濟(jì)寧 272029)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)是目前最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，多發(fā)于神經(jīng)外胚層，占顱內(nèi)腫瘤的40%～50%[1]。該腫瘤增殖速度快、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和術(shù)后易復(fù)發(fā)，即使在成功切除、放療和化療(替莫唑胺)治療后，腫瘤復(fù)發(fā)率仍然很高，導(dǎo)致治療效果非常差[2]。柯里拉京(Corilagin)具有抗腫瘤[3]、抗炎[4]和保肝作用[5]等。然而，由于復(fù)雜而低效的提取方法，它的藥理性能很少受到關(guān)注。近年來(lái)，隨著萃取技術(shù)的發(fā)展，Corilagin比以往更容易獲得。因此，人們開(kāi)始重新關(guān)注其抗腫瘤、保肝和抗炎活性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在不同時(shí)間點(diǎn)分別用200μg/ml Corilagin干預(yù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞,分析Corilagin對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的影響，為膠質(zhì)瘤的進(jìn)一步藥物治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

U251細(xì)胞系(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心);DMEM/F12(上海博升生物科技有限公司);胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司);PBS緩沖液(普諾賽生命科技有限公司);雙抗(美國(guó)Solarbio公司);胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司);DMSO(美國(guó)Sigma 公司);柯里拉京(美國(guó)Sigma公司);細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 U251細(xì)胞培養(yǎng)

取出U251細(xì)胞系放在含有DMEM / F12和10%FBS的細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2的飽和濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基每1～2天更新1次。

1.3 凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞接種到6孔板中，實(shí)驗(yàn)組每孔加2ml配制的含200μg/ml Corilagin的培養(yǎng)基，對(duì)照組每孔加入2ml完全培養(yǎng)基，分別干預(yù)24、48、72h，每組都設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)上的程序?qū)?xì)胞進(jìn)行染色，染色完成即通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),其中AnnexinV-FITC顯示為綠色熒光,PI顯示為紅色熒光。記錄AnnexinV-FITC(+)PI(+)和AnnexinV-FITC(+)PI(-)作為凋亡細(xì)胞,每次計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞,計(jì)算各組凋亡率。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

在恒溫箱中取出接種于6孔板生長(zhǎng)良好的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，吸盡培養(yǎng)液后，用直尺在6孔板背后用記號(hào)筆均勻畫(huà)橫線(xiàn)，用無(wú)菌10μl移液管頭與標(biāo)尺比齊，盡可能在6孔板后方的水平線(xiàn)上均勻劃行；用200μg/ml藥物濃度的柯里拉京干預(yù)細(xì)胞3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24、48、72h)，每組設(shè)置5個(gè)平行孔；最終將6孔板放置于熒光倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞遷移情況；測(cè)量并記錄細(xì)胞遷移距離；細(xì)胞遷移度(%)=(劃痕時(shí)兩側(cè)細(xì)胞距離-檢測(cè)時(shí)兩側(cè)細(xì)胞距離)/劃痕時(shí)兩側(cè)細(xì)胞距離×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 U251細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察

在恒溫箱中分別取出接種于6孔板生長(zhǎng)良好的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，分別用不同藥物濃度的Corilagin 3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(24、48、72h)干預(yù)細(xì)胞，然后放在熒光倒置顯微鏡下觀(guān)察，可以發(fā)現(xiàn)未經(jīng)Corilagin干預(yù)的U251細(xì)胞生長(zhǎng)良好，具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并附著于6孔板的壁上(見(jiàn)圖1A)。200μg/ml Corilagin干預(yù)72h后，細(xì)胞變小，細(xì)胞密度減少，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞凋亡增加(見(jiàn)圖1B)。

注：A,正常培養(yǎng)的U251；B,200μg/ml Corilagin干預(yù)U251細(xì)胞72h

圖1 200μg/ml Corilagin對(duì)U251細(xì)胞的影響(×100)

2.2 Corilagin促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡

U251細(xì)胞經(jīng)200μg/ml的Corilagin干預(yù)24、48、72h后，經(jīng)凋亡試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在200μg/ml濃度干預(yù)下，U251細(xì)胞凋亡率隨Corilagin干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增高(P<0.05)。 見(jiàn)表1。

表1 兩組U251細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較(%)

2.3 Corilagin能有效抑制U251細(xì)胞的遷移

Corilagin能抑制U251細(xì)胞的遷移能力，與對(duì)照組相比，200μg/ml Corilagin能明顯降低U251細(xì)胞的遷移度。劃痕后的U251細(xì)胞在含200μg/ml Corilagin 血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、48、72h后U251細(xì)胞遷移度均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 200μg/ml Corilagin對(duì)U251細(xì)胞遷移能力的影響(×100)

3 討論

膠質(zhì)瘤是一種最常見(jiàn)的腦腫瘤類(lèi)型，具有侵襲性強(qiáng)和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)[6]，盡管經(jīng)過(guò)手術(shù)、化療、放療等綜合治療后，膠質(zhì)瘤患者的中位生存期仍?xún)H有18個(gè)月[7]。為提高膠質(zhì)瘤患者的臨床治療效果，目前迫切需要一種新的治療方法來(lái)替代傳統(tǒng)的手段。根據(jù)腫瘤增殖/凋亡理論[8]，腫瘤的形成跟細(xì)胞增殖與凋亡的失衡有很大關(guān)系，因此，探索誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)藥物及其作用靶點(diǎn)，能夠?yàn)閻盒阅[瘤的治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本文應(yīng)用Corilagin干預(yù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著藥物干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，Corilagin促使膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的凋亡率逐漸增高，膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的遷移度降低，說(shuō)明Corilagin能夠抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，它對(duì)哺乳動(dòng)物的發(fā)育和維持機(jī)體平衡方面起著關(guān)鍵作用[9]，它可以消除任何不必要或不需要的細(xì)胞，并且這是一個(gè)受到嚴(yán)格控制的過(guò)程。有多種因素可導(dǎo)致凋亡途徑被激活，包括DNA損傷或不受控制的增殖[10]。細(xì)胞凋亡有細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩種途徑激活。細(xì)胞內(nèi)途徑激活信號(hào)包括DNA損傷、生長(zhǎng)因子剝奪和細(xì)胞因子剝奪，最常見(jiàn)的細(xì)胞外途徑激活信號(hào)是由受損或感染的細(xì)胞免疫系統(tǒng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞產(chǎn)生的死亡誘導(dǎo)信號(hào)來(lái)介導(dǎo)[11]。對(duì)于Corilagin促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡及抑制其遷移的機(jī)制尚不十分明確。Livin(又稱(chēng)KIAP或ML-IAP)是細(xì)胞凋亡蛋白抑制因子家族中的一員。該蛋白在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期中起關(guān)鍵作用。Livin在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于人腦膠質(zhì)細(xì)胞[12]。Corilagin可能通過(guò)抑制Livin的表達(dá)從而促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白的分解，破壞體內(nèi)的組織學(xué)屏障，從而使膠質(zhì)瘤更容易浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[13]，因此，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲及擴(kuò)散的方法就是首先要抑制腫瘤細(xì)胞中MMPs的活性。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，中草藥提取物Corilagin能夠有效抑制MMPs的活性，可以顯著抑制膠質(zhì)瘤在體內(nèi)遷移和擴(kuò)散[14]。但是Corilagin作為一種新藥，關(guān)于其對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的確切分子機(jī)制尚不完全清楚，還需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，Corilagin能促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的凋亡，并抑制其遷移能力，說(shuō)明Corilagin對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。該結(jié)論補(bǔ)充了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡、耐藥理論，揭示了新型化療藥物Corilagin對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。盡管本研究還存在一定的局限性，但是Corilagin的上述作用為膠質(zhì)瘤的治療拓寬了思路，對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的臨床治療提供了理論依據(jù)。

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