張 磊 劉志強 徐祥文

(1日照市人民醫(yī)院， 日照 276000;2濟寧醫(yī)學院藥學院;3日照市120緊急救援指揮中心，日照 276826)

近年，經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術、冠脈搭橋術等缺血-再灌注治療手段增多，心肌缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷備受關注[1]。紅花(CarthamustinctoriusL)可通過清除自由基、增強酶的活性、擴張血管等方面起到抗心肌缺血作用[2]。本實驗通過結(jié)扎右冠狀動脈建立心肌缺血動物模型，并從心肌酶檢測、BCL-2蛋白表達、心肌梗死面積測量及病理切片鏡像改變等方面研究紅花對心肌缺血-再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 氯化三苯四唑啉(上?；瘜W試劑廠);BCL-2免疫試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);紅花注射液(亞寶藥業(yè)集團股份有限公司)。

1.1.2儀器 心電圖機(ECG-1150日本)；OLYMPUS顯微鏡(TOKYO日本)；LX20全自動生化分析儀(Beckman-Couher美國)；病理切片機(美國AO公司)。

1.1.3實驗動物及分組 健康兔30只，實驗過程中死亡7只,補7只,共37只，體重2.0～2.5kg,雌雄不拘，濟寧醫(yī)學院動物房提供，動物許可證號：SCXK(魯)2014-0007，實驗動物符合實驗動物福利和動物倫理學的要求。

動物隨機分為3組，每組10只，假手術組，在右冠狀動脈下穿無創(chuàng)傷絲線，但不結(jié)扎；缺血-再灌注損傷組，缺血30min，再灌注120min；紅花組為紅花注射液在缺血前30min，2ml/kg耳緣靜脈注射，缺血30min，再灌注120min。

1.2 方法

1.2.1兔心肌缺血-再灌注模型建立 20%烏拉坦5ml/kg兔耳緣靜脈緩慢注入，兔呼吸慢而平穩(wěn)、肌張力下降且角膜反射消失即表示麻醉成功。隨后將兔仰臥于手術臺上將四肢和上顎固定，胸前剪毛。先沿胸骨中線右側(cè)逐層剪開皮膚、皮下組織，可見肋骨，再沿肋骨右緣剪斷3～5根肋骨，撐開胸腔，暴露心臟。觀察到心臟跳動有力，右肺略有萎縮，用鑷子輕夾起心包膜后剪開2cm左右的開口，牽拉右心耳，暴露右房室間溝。在距右房室間溝約5mm處右心室壁上可見右冠狀動脈。將無創(chuàng)傷縫合線環(huán)繞右冠狀動脈，將該縫合線從自制皮管內(nèi)穿出置于體外，迅速縫合關胸。用針管從自制皮管中抽氣，使右肺膨脹，抽緊環(huán)繞線造成右冠狀動脈缺血，用止血鉗夾住皮管，防止空氣進入胸腔，觀察呼吸是否平穩(wěn)、心率是否正常。逐層將胸腔和表皮縫合，缺血30min，心電圖機行心電監(jiān)護，隨后松開環(huán)繞線恢復心肌灌注120min。在心肌再灌注2h后從心臟取血，測定CK和LDH含量。取出心臟，在右心室前壁取1.2cm×1.5cm心肌，備用做病理切片，每組5個心臟冷藏后取出做心臟切片觀察心肌梗死面積。紅花組紅花注射液在缺血前30min，2ml/kg耳緣靜脈注射，假手術組、缺血-再灌注損傷組在缺血前30min注射等量生理鹽水。

1.2.2心電圖觀測 采用ECG-1150心電圖機對各組兔做心電圖。以針刺電極插于兔四肢皮下，全程監(jiān)測標準肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。再灌注后ST值均有降低，降低的ST值稱為ST回落值，即ΔST值(ΔST=結(jié)扎后30min ST值-復灌后ST值)。

1.2.3心肌酶檢測 再灌注2h后從心臟取血，用LX20全自動生化分析儀(美國)檢測心肌酶含量，包括CK、LDH ，速率法檢測。

1.2.4心肌梗死范圍觀測 1)取材 動物缺血-再灌注后取出心臟生理鹽水沖洗后放置冰箱冷藏。2)心肌梗死范圍觀測 取兔冷藏心臟，每組各取5只，去除心房，沿水平方向?qū)⑿氖壹∏谐杉s 2～3mm的圓薄片，用濾紙將心肌薄片吸干，置于37℃的1%氯化三苯四唑啉磷酸緩沖液 (pH=7.4)內(nèi)，水浴 15～30 min，確定梗死組織面積，觀察梗死區(qū)域(灰白色)和正常心肌區(qū)域(紅色)面積。

心肌損傷觀測：1)取材 動物缺血-再灌注后取心臟，在右心室前壁上取1.2cm×1.5cm的心肌。2)固定 把取出的標本放入4%多聚甲醛緩沖液中6～8h。3)染色 石蠟包埋HE染色。4)拍照 用OLYMPUS光學顯微鏡觀察，明美數(shù)碼成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5檢測BCL-2蛋白陽性細胞數(shù) 采用HP IAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，于200倍光鏡下選擇血腫周圍陽性細胞表達明顯區(qū)域的3個相鄰視野區(qū)，計數(shù)陽性細胞數(shù)，計算平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件 SPSS 13.5分析實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 各組兔心電圖變化

與假手術組相比，缺血-再灌注損傷組心電圖ST段抬高，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)；與缺血-再灌注損傷組相比，紅花組心電圖ST段抬高降低，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。見表1。

表1 3組心電圖ST段高度值比較

注：與假手術組相比，*P<0.05；與缺血-再灌注損傷組相比，△P<0.05

2.2 各組兔心肌酶變化

與假手術組相比，缺血-再灌注損傷組CK和LDH水平增加,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)；與缺血-再灌注損傷組相比，紅花組CK和LDH水平顯低,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。見表2。

表2 3組心肌酶檢測數(shù)值比較

注：與假手術組相比，*P<0.05；與缺血-再灌注損傷組相比，△P<0.05

2.3 各組兔心肌梗死范圍檢測結(jié)果

假手術組右心室無梗死發(fā)白，缺血-再灌注損傷組右心室梗死發(fā)白較明顯，紅花組與缺血-再灌注損傷組比較右心室梗死發(fā)白減輕。見圖1。

假手術組 缺血-再灌注損傷組 紅花組

圖1 3組兔心肌梗死檢測結(jié)果

2.4 各組兔病理切片檢測結(jié)果

缺血-再灌注損傷組梗死區(qū)部分毛細血管擴張，細胞出現(xiàn)空泡，模糊不清晰，細胞核顏色變淺，細胞質(zhì)出現(xiàn)腫脹，纖維排列不規(guī)則，紅花組出現(xiàn)輕微的血管充血，較少出現(xiàn)細胞固縮、形態(tài)結(jié)構改變。見圖2。

假手術組 缺血-再灌注損傷組 紅花組

圖2 3組兔心肌細胞形態(tài)

2.5 各組兔BCL-2蛋白表達情況

與假手術組相比，缺血-再灌注損傷組BCL-2蛋白陽性細胞數(shù)增多，與缺血-再灌注損傷組相比，紅花組BCL-2蛋白陽性細胞數(shù)顯著減少。見表3、圖3。

假手術組 缺血-再灌注損傷組 紅花組

注：與假手術組相比，*P<0.05；與缺血-再灌注損傷組相比，△P<0.05

3 討論

缺血-再灌注損傷可發(fā)生于溶栓、經(jīng)皮穿刺冠狀動脈腔內(nèi)成形術、冠狀動脈旁路移置術、各種冠狀動脈再通術和心臟移植術后，嚴重威脅人類健康。國內(nèi)外同行[3-5]對左冠狀動脈缺血-再灌注損傷做了較多研究，而人及哺乳類動物90%以上的房室結(jié)動脈及2/3的竇房結(jié)動脈均起源于右冠狀動脈，右冠狀動脈位置深，變異較大，從而對右冠狀動脈的研究增加了難度。本文觀察了紅花注射液[6-7]對在體兔右心缺血-再灌注損傷的影響，通過紅花預處理后結(jié)扎右冠狀動脈缺血30min，再灌注120min后心肌損傷減輕，其對右心缺血-再灌注損傷的保護，在國內(nèi)外未見報道。

本文缺血-再灌注損傷組與假手術組比較，心電圖抬高顯著，CK、LDH明顯升高，右心室心肌梗死明顯，病理切片HE染色細胞損傷嚴重,BCL-2蛋白表達升高，說明結(jié)扎右冠狀動脈造成右心缺血-再灌注損傷明顯；紅花組與缺血-再灌注損傷組比較，紅花組的各項指標均降低，說明紅花減輕了缺血-再灌注的損傷。

當發(fā)生心肌梗死時心肌氧攝取率降低，對自由基清除能力下降，心肌細胞內(nèi)氧自由基爆發(fā)式增長[8]，通過系列病理生理作用，引發(fā)心肌缺血-再灌注損傷。紅花通過抑制氧自由基生成、增強心肌酶活性、改善微循環(huán)等作用減輕缺血-再灌注過程中心肌細胞的損傷[9]，對兔心肌缺血-再灌注損傷起到保護作用，臨床上在應用紅花預防心缺血-再灌注損傷具有廣闊前景，對臨床治療具有指導意義。

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