孫珊珊 張 千 丁 林 劉樹玲 劉玉國 李艷芝△

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 日照 276826；2濟(jì)寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心， 濟(jì)寧 272000)

蒲公英為常用的藥食兩用中藥材，其嫩苗是人們喜愛的野菜，含有多種維生素和人體所必需的常量和微量元素[1-2]，具有很高的食用價(jià)值，食用歷史悠久，早在《唐本草》中就有記載[3]。蒲公英含有黃酮類、萜類等化學(xué)成分[4-5]，具有免疫調(diào)節(jié)等作用[6]。本文探討了不同采收期蒲公英根、葉、花中總黃酮含量變化規(guī)律，并觀測(cè)其對(duì)小鼠體液免疫功能的影響，為其合理采收利用及藥效學(xué)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1原料及試劑 蒲公英藥材采集于山東日照，經(jīng)濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院王建安副教授鑒定，采集時(shí)間3月25日至6月25日，期間每月10日、25日采摘，采集總量為500g，50℃烘干后備用。樣品保存于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥標(biāo)本室。槲皮素對(duì)照品(南昌貝塔生物科技有限公司)。HPD-400型大孔樹脂購自上海勁凱樹脂有限公司。Drabkin試劑(D5941-6VL，Sigma公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)KM小鼠，(20±2)g，雌雄兼用；新西蘭家兔，(2±0.2)kg；豚鼠，(200±20)g。以上動(dòng)物均采購于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可編號(hào)2009-0001)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)福利和動(dòng)物倫理學(xué)的要求。

1.1.3儀器 紫外可見分光光度計(jì)(UV754N，上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；離心機(jī)(LD5-2A，北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)；超聲波提取機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 總黃酮含量測(cè)定

1.2.1供試品溶液的制備 將采集于不同時(shí)期的蒲公英根、葉、花藥材，50℃干燥，粉碎過40目篩，分別稱量藥材粉末100g，加入65%乙醇50ml浸泡30min后，在60℃、80KHz的頻率下超聲提取3次，每次20min，冷卻后抽濾合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑得提取浸膏，按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行純化，回收洗脫液得浸膏，再用甲醇將浸膏溶解，將其轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，加甲醇定容，搖勻得待測(cè)液。

1.2.2對(duì)照品溶液的配制 用萬分之一分析天平稱取槲皮素對(duì)照品0.0100g，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶，甲醇定容，得槲皮素對(duì)照品溶液，濃度為 0.1 mg/ml。

1.2.3檢測(cè)波長的選擇 取蒲公英供試品溶液和槲皮素對(duì)照品溶液，按照文獻(xiàn)[7]的方法顯色，于200～700 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行全程掃描，掃描結(jié)果兩者在388 nm 波長處均出現(xiàn)最大吸收，且干擾小，故選擇檢測(cè)波長為388 nm。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用移液管準(zhǔn)確量取1.2.2項(xiàng)下的槲皮素對(duì)照品溶液 0、1、2、3、4、5、6ml，分別轉(zhuǎn)移到25ml容量瓶中，按照文獻(xiàn)[8]的方法顯色，用甲醇定容，在388 nm 波長處測(cè)定其吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程為Y=25.518X-0.0076，r=0.9995。

1.2.5總黃酮含量測(cè)定 精密量取不同編號(hào)的供試品溶液1ml，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，按照1.2.4項(xiàng)下方法配制溶液，于388 nm波長處測(cè)定其吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算得出各藥材總黃酮含量。

1.3 小鼠體液免疫功能的測(cè)定

1.3.1蒲公英供試液的制備 分別稱取4月10日采集的蒲公英花、葉、根藥材粉末5g，按照1.2.1項(xiàng)下方法得總黃酮浸膏，在100ml容量瓶中用蒸餾水定容，配得濃度為0.05g/ml的蒲公英供試液。

1.3.2兔血紅細(xì)胞懸液的制備 家兔耳緣靜脈取血20ml，離心2000r/min，5min，棄上清液；加與沉淀等量的生理鹽水，離心1500r/min，5min，清洗2次，棄上清液；離心2000r/min，10min，棄上清液，得兔血紅細(xì)胞，用生理鹽水1∶5稀釋，得兔血紅細(xì)胞懸液，測(cè)定小鼠體液免疫功能時(shí)用作抗原。

1.3.3豚鼠血清溶液的制備 取豚鼠心臟血10ml，離心2000r/min，10min，取上清，用生理鹽水1∶10(V∶V)稀釋，置于4 ℃冰箱中備用，測(cè)定小鼠體液免疫功能時(shí)用作補(bǔ)體。

1.3.4溶血素測(cè)定法測(cè)定小鼠體液免疫功能[9]50只KM小鼠隨機(jī)分為空白組(生理鹽水)、陽性對(duì)照組(黃芪精口服液)、蒲公英根、葉、花供試液組，共5組，每組10只，分別灌胃給藥0.5ml，給藥后0.5h，每鼠腹腔注射0.2ml兔血紅細(xì)胞懸液，免疫小鼠常規(guī)喂養(yǎng)6d，眼球取血，處理樣品[10]，離心2000r/min，10min，取上層血清，用生理鹽水稀釋500倍。取1ml已稀釋好的血清置于試管中，加入兔血紅細(xì)胞懸液0.5ml，將試管置于冰浴中冷卻，向試管中加入補(bǔ)體1ml，再將其移至37℃恒溫水浴中，保溫10min，隨即放置于冰浴中。2000r/min，10min，取上清液，測(cè)其吸收度。經(jīng)兔紅細(xì)胞免疫后的小鼠，可產(chǎn)生兔紅細(xì)胞抗體即溶血素，血清溶血素含量以半數(shù)溶血值(HC50)表示。計(jì)算公式如下式即抗體含量。

×稀釋倍數(shù)

(1)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 蒲公英中總黃酮含量

4月10日各器官中總黃酮的含量比其它時(shí)期含量高，花中總黃酮含量最高。見表1。

表1 蒲公英中總黃酮含量(%)

注：-表示沒有蒲公英花

2.2 小鼠體液免疫功能測(cè)定結(jié)果

蒲公英根、葉、花總黃酮均有增強(qiáng)小鼠體液免疫功能的作用，其中花作用最強(qiáng)，與黃芪精口服液組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 蒲公英根、葉、花總黃酮對(duì)小鼠半數(shù)溶血值(HC50)的影響

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與陽性對(duì)照組相比，△P>0.05。

3 討論

本文結(jié)果顯示，同一時(shí)期蒲公英不同部位的總黃酮含量有明顯差異，其高低順序?yàn)榛?葉>根，與蒲公英的傳統(tǒng)藥用部位為地上部分相一致。中藥質(zhì)量取決于其中有效物質(zhì)的含量，而有效物質(zhì)的含量高低與采收期有密切關(guān)系。蒲公英是人們喜愛的綠色保健中草藥，為使其發(fā)揮更大的保健作用，筆者測(cè)定了不同時(shí)期蒲公英總黃酮含量，結(jié)果表明，3～6月份蒲公英花、葉、根中總黃酮含量變化遵循逐漸升高達(dá)到峰值又逐漸降低的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，4月10日各器官中總黃酮的含量達(dá)到最高值，其中花含量最高，該結(jié)果為蒲公英的合理采收提供了科學(xué)依據(jù)。

本文以HC50觀測(cè)蒲公英根、葉、花對(duì)小鼠體液免疫功能的影響。筆者選取總黃酮含量最高的4月10日蒲公英花、葉、根，研究了其對(duì)小鼠體液免疫功能的影響，結(jié)果表明均有增強(qiáng)小鼠體液免疫的作用，其中花作用最強(qiáng)，該結(jié)果為蒲公英藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供了參考。綜上所述，蒲公英花中總黃酮含量最高，而且增強(qiáng)小鼠體液免疫的作用最強(qiáng)，有必要對(duì)其展開深入研究，如開發(fā)蒲公英花茶等保健品。

[1] 孫玉順,姜秋杰,唐曉珍.野菜蒲公英的開發(fā)與利用[J].食品研究與開發(fā),2003,24(6):101-103.

[2] 袁瑾,鐘華,姚宗仁,等.野生植物蒲公英營養(yǎng)成分的研究[J].氨基酸和生物資源,2006,28(2):22-23.DOI:10.3969/j.issn.1006-8376.2006.02.006.

[3] 周震.蒲公英藥理研究與臨床應(yīng)用[J].光明中醫(yī),2009,24(9):1801-1802.DOI:10.3969/j.issn.1003-8914.2009.09.121.

[4] 趙守訓(xùn).蒲公英的化學(xué)成分和藥理作用[J].中國野生植物資源,2001,20(3):1-3.

[5] 谷肄靜,王立娟.蒲公英總黃酮的提取及其抑菌性能[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,35(8):43-45.

[6] 謝沈陽,楊曉源,丁章貴,等.蒲公英的化學(xué)成分及其藥理作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012,24(S1):141-151.

[7] 鄭淑霞,易駿,吳錦忠,等.大孔樹脂純化蓮房總黃酮的工藝研究[J].中國藥房,2015,26(31):4405-4408.DOI:10.6039/j.issn.1001-0408.2015.31.28.

[8] 李艷芝，王建安，張辰辰.連翹花中總黃酮提取工藝的優(yōu)化[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012,32(18):1502-1504.

[9] 張均田.現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法(上冊(cè))[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)/中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1998:855-856.

[10] 仇成鳳，雷林生，吳玉英，等.以兔紅細(xì)胞作為抗原建立小鼠體液免疫反應(yīng)動(dòng)物模型[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,29(12):2473-2476.