付 博，段 杉，齊 明，陳嘉盛

（1.佛山職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品系，廣東 佛山 528137；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

啤酒穩(wěn)定性研究是啤酒行業(yè)多年來的重要課題[1-3]。啤酒生產(chǎn)中添加合適的酶，可以穩(wěn)定或提高啤酒的質(zhì)量[4-6]，這使得越來越多的企業(yè)在啤酒生產(chǎn)過程中添加各種酶制劑，但使用單一的酶來提高啤酒澄清度會因酶的專一性帶來一定的局限性[7-9]，如單一的酶澄清劑受酶高度專一特性的限制，難以解決啤酒因不同原因產(chǎn)生的渾濁、沉淀問題[10]。而將單一酶制成復(fù)合酶制劑則可彌補各種酶的缺點，得到較好的效果[11-14]。因此，啤酒復(fù)合酶澄清劑將是啤酒澄清劑研發(fā)的重要方向，具有很高的研究價值。

本試驗通過單因素試驗選定果膠酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶作為啤酒復(fù)合酶澄清劑，并在小試試驗中研究了其用量對啤酒澄清度及pH、濁度、持泡性、色度的影響，從中選取對啤酒澄清度及其他質(zhì)量指標(biāo)提高最明顯的添加量，并在此基礎(chǔ)上利用Box-Behnken試驗設(shè)計對發(fā)酵過程中果膠酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶的用量進(jìn)行優(yōu)化，并以小試試驗確定的復(fù)合酶澄清劑進(jìn)行中試試驗，對啤酒質(zhì)量進(jìn)行檢測，并對啤酒感官指標(biāo)進(jìn)行評定，以此驗證其效果，旨在為配制啤酒復(fù)合酶澄清劑應(yīng)用于生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 啤酒生產(chǎn)原料

麥芽（澳大利亞）、啤酒花（捷克苦花、捷克香花）、法國S-189下面酵母酵母：市售。

1.1.2 酶制劑

木瓜蛋白酶（酶活80萬U/g）、菠蘿蛋白酶（酶活50萬U/g）、果膠酶（酶活20萬U/g）、中性蛋白酶（酶活6萬U/g）：鄭州萬博化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限；PHS-3C酸度計：上海儀電科學(xué)儀器有限公司；WGZ-2PJ濁度計：上海聽瑞儀器儀表有限公司；DV314C電子分析天平：美國奧豪斯公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 啤酒發(fā)酵條件

前發(fā)酵時間為4～5 d，發(fā)酵溫度為12℃；后發(fā)酵時間5～6 d，發(fā)酵溫度12℃；發(fā)酵完成后以雙層中速濾紙抽濾。

1.3.2 酶制劑的篩選

本試驗根據(jù)酶制劑在啤酒澄清方面的研究報道[10]，以麥芽質(zhì)量計，分別研究木瓜蛋白酶（640 U/100 g）、果膠酶（800 U/100 g）、中性蛋白酶（90 U/100 g）、菠蘿蛋白酶（800 U/100 g）對啤酒的澄清效果；在麥汁糖化冷卻后，在4種小試樣中分別加入酶（以無菌冷水溶解酶粉后加入）后進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵完成后，對啤酒的濁度、色度、pH、持泡性、感官指標(biāo)（包括色澤、香氣、泡沫、口感）進(jìn)行分析，確定其中3種澄清效果較好的酶制劑作為啤酒復(fù)合酶澄清劑，并通過單因素試驗確定較好添加量。

1.3.3 Box-Behnken試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用3因素3水平Box-Behnken試驗設(shè)計連同響應(yīng)面法優(yōu)化3種酶的添加量以提高啤酒質(zhì)量。Box-Behnken響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.4 檢測方法

采用國標(biāo)GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[15]測定啤酒的色度（分光光度計法）、濁度、持泡性（秒表法）、啤酒品質(zhì)感官評價、總酸（指示劑法）、酒精度（密度瓶法）；pH的測定[16]：用pH 4.00和pH 6.86的緩沖溶液校準(zhǔn)pH計后測定；α-氨基酸態(tài)氮測定[17]：茚三酮法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶制劑初步篩選結(jié)果

表2 添加各種酶對啤酒質(zhì)量的影響Table 2 Effect of adding various enzymes on beer quality

由表2可知，在加入各種酶制劑后，除加入中性蛋白酶的試樣濁度略微提高外，其他均有不同程度的降低，色度下降明顯，持泡性總體上略有提高；添加酶后發(fā)酵液pH值變化不大；除木瓜蛋白酶與原啤酒總體風(fēng)格不符外，其他3種酶對啤酒主要感官評價影響不大。因此，初步選擇果膠酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶配制啤酒復(fù)合酶澄清劑，并進(jìn)一步研究其用量對啤酒澄清度和其他質(zhì)量指標(biāo)的影響。

2.2 果膠酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶添加量對啤酒質(zhì)量的影響

由表3可知，添加720U/100g、760U/100g、800U/100g、840 U/100 g、880 U/100 g的果膠酶后，啤酒濁度均有不同程度的降低；色度下降明顯；持泡性總體上略有提高（添加760 U/100 g麥芽時略有降低）；發(fā)酵液pH值變化不大；果膠酶添加量為840 U/100 g時啤酒感官評分較高，因此選擇果膠酶添加量為800 U/100 g、840 U/100 g、880 U/100 g麥芽進(jìn)行后續(xù)試驗。

表3 果膠酶添加量對啤酒質(zhì)量的影響Table 3 Effect of pectinase addition on beer quality

由表4可知，添加78 U/100 g、84 U/100 g、90 U/100 g、96 U/100 g、102 U/100 g的中性蛋白酶后，啤酒濁度除添加78 U/100 g有明顯下降外（下降幅度達(dá)到21.1%），其他添加量條件下均有所提高，但增幅均不明顯；色度下降明顯；持泡性有不同程度的提高；發(fā)酵液pH值變化不大；果膠酶添加量為78 U/100 g、84 U/100 g時，啤酒感官評分較高。綜合考慮啤酒的濁度、色度及感官評分，選擇中性蛋白酶添加量為78U/100g、84U/100g、90U/100g麥芽進(jìn)行后續(xù)試驗。

表4 中性蛋白酶添加量對啤酒質(zhì)量的影響Table 4 Effect of neutral-protease addition on beer quality

由表5可知，添加600U/100 g、700 U/100 g、800 U/100 g、900 U/100 g、1 000 U/100 g麥芽的菠蘿蛋白酶后，啤酒濁度除添加600 U/100 g麥芽時略有提高外，其他添加量均有不同程度的降低；色度下降明顯；持泡性有不同程度的提高；發(fā)酵液pH值變化不大；啤酒感官評分與對照相比波動不大?？紤]到啤酒的濁度和色度是評價啤酒澄清度的最重要指標(biāo)，因此選擇菠蘿蛋白酶添加量為800 U/100 g、900 U/100 g、1 000 U/100 g麥芽進(jìn)行后續(xù)試驗。

表5 菠蘿蛋白酶添加量對啤酒質(zhì)量的影響Table 5 Effect of bromelain addition on beer quality

2.3 Box-Behnken試驗優(yōu)化酶添加量

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用3因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計連同響應(yīng)面法優(yōu)化3種酶（X1果膠酶、X2中性蛋白酶、X3菠蘿蛋白酶）的添加量以提高啤酒質(zhì)量，即獲得pH值（Y1）波動小、濁度（Y2）低、持泡性（Y3）好、色度（Y4）低的啤酒。

選擇Box-Behnken進(jìn)行3水平的試驗設(shè)計，得到（15×3）的矩陣，一共15次試驗；其中1～12號是析因試驗，13～15號是中心試驗。15個試驗點分為析因點和零點，其中分析因點為自變量取值在X1、X2和X3所構(gòu)成的三維頂點；零點為區(qū)域的中心點，零點試驗重復(fù)3次，用以估計試驗誤差。具體的試驗設(shè)計見表6。

在以上試驗設(shè)計的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式的響應(yīng)曲面分析（模型置信度取值為95%）；采用MATLAB 7.0作模型的平面預(yù)測線，得到啤酒質(zhì)量的響應(yīng)面參數(shù)。

表6 酶的添加量優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments forenzyme addition optimization

麥汁質(zhì)量指標(biāo)與各種酶添加量之間的回歸方程如下：

2.4 外加酶對啤酒質(zhì)量指標(biāo)的影響

2.4.1 外加酶對啤酒發(fā)酵pH的影響

圖1 果膠酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶添加量交互作用對啤酒發(fā)酵pH值影響的響應(yīng)面和等高線Fig.1 Response surface plots and coutour line of effects of interaction between pectinase,neutral-protease and bromelain addition on pH value of beer

由圖1可知，3種酶的添加量對pH值的影響不顯著，即添加各種酶對發(fā)酵的pH沒有太大的影響。考慮到在發(fā)酵過程pH相對穩(wěn)定對生產(chǎn)比較有利，因此得出，果膠酶添加量為820～860 U/100 g時較好；中性蛋白酶添加量為84～88 U/100 g時較好；菠蘿蛋白酶添加量為860～910 U/100 g時較好。說明酶制劑對響啤酒發(fā)酵的pH環(huán)境影響很小。

2.4.2 外加酶對啤酒發(fā)酵濁度的影響

圖2 果膠酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶添加量交互作用對啤酒濁度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surface plots and coutour line of effects of interaction between pectinase,neutral-protease and bromelain addition on turbidity of beer

由圖2可知，3種酶的添加對啤酒的濁度影響很顯著。濁度隨菠蘿蛋白酶添加量的提高而上升。同時，濁度也隨著中性蛋白酶添加量的增加呈現(xiàn)出總體上升的趨勢。而濁度隨著果膠酶添加量的提高而上升，而后有一種下降趨勢。總體而言，這3種酶對濁度的擬合較好，果膠酶添加量為800U/100g或880U/100g、中性蛋白酶添加量為78 U/100 g、菠蘿蛋白酶添加量為800 U/100 g時均能找到最低濁度。

2.4.3 外加酶對啤酒發(fā)酵持泡性的影響

由圖3可知，持泡性受中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶的影響較明顯，受果膠酶的影響較弱。只要保證中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶的添加量在合適的范圍內(nèi)，持泡性就能保持在125 s以上?？紤]到持泡時間長啤酒質(zhì)量較好，因此中性蛋白酶添加量為78 U/100 g、菠蘿蛋白酶添加量為880～905 U/100 g時持泡性最好，而果膠酶對持泡性的影響則可忽略。

圖3 果膠酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶添加量交互作用對啤酒發(fā)酵持泡性影響的響應(yīng)面和等高線Fig.3 Response surface plots and coutour line of effects of interaction between pectinase,neutral-protease and bromelain addition on foam-holding of beer

2.4.4 外加酶對啤酒色度的影響

圖4 果膠酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶交互作用對啤酒色度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and coutour line of effects of interaction between pectinase,neutral-protease and bromelain addition on chroma of beer

由圖4可知，色度受酶添加量的影響十分顯著。三種酶對色度的擬合很好，在測定范圍內(nèi)均能找到最低的色度。果膠酶添加量為880 U/100 g、中性蛋白酶添加量為78 U/100 g、菠蘿蛋白酶添加量為840～880 U/100 g時啤酒色度達(dá)到最低。

2.5 響應(yīng)面分析結(jié)果的試驗驗證

確定酶的最優(yōu)添加量應(yīng)能保證啤酒發(fā)酵時的穩(wěn)定性，同時，為了保證啤酒產(chǎn)品的口感、風(fēng)味不受影響，因此添加酶制劑時要遵守盡量不加或盡量少加的原則，并且要考慮使用成本與添加效率之間的平衡。因此，在綜合考慮啤酒質(zhì)量指標(biāo)（特別是對啤酒澄清度有顯著影響的指標(biāo)：濁度）及添加酶制劑的原則后，進(jìn)一步確定了最佳添加量，即果膠酶添加量為880 U/100 g、中性蛋白酶添加量為78 U/100 g、菠蘿蛋白酶添加量為800 U/100 g。而在此條件下，啤酒指標(biāo)理論值pH值為4.58，濁度為9.03 EBC，持泡性為144.3 s，色度為10.1 EBC。

為了驗證數(shù)據(jù)模型的準(zhǔn)確性，在以上最優(yōu)添加量下進(jìn)行了3次平行重復(fù)性發(fā)酵試驗，結(jié)果見表7。由表7可知，添加酶制劑后啤酒的pH值為4.58（提高0.2%），濁度為7.7 EBC（降低14.4%），持泡性為144s（提高102.8%），色度為9.9EBC（降低2.9%），總酸為0.34 mL/100 mL（未變化），酒精度為4.4%vol（提高7.3%），α-氨基酸態(tài)氮為181mg/L（提高15.3%），感官評分為84.67分（提高0.67%）。

表7 復(fù)合酶澄清劑對啤酒質(zhì)量的影響Table 7 Effect of compound enzyme clarifier on beer quality

3 結(jié)論

通過對酶篩選試驗選取了果膠酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶作為啤酒復(fù)合酶澄清劑，并利用Box-Behnken試驗設(shè)計對其的添加量進(jìn)一步優(yōu)化，通過響應(yīng)面試驗得出最優(yōu)酶的添加量為果膠酶880 U/100 g，中性蛋白酶78 U/100 g，菠蘿蛋白酶800 U/100 g。在此條件下，啤酒的濁度降低了14.4%，色度降低了2.9%，持泡性提高了102.8%，α-氨基酸態(tài)氮含量提高了15.3%。這種啤酒復(fù)合酶澄清劑的添加對啤酒的總酸、酒精度、pH值、感官評價沒有太大的影響，更重要的是啤酒濁度、色度均有下降，起到了較為明顯的澄清作用，具有很高的應(yīng)用價值。

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