于 輝，張鵬飛，杜 娟，馬 霖，邵 帥，萬曉冬

(即墨區(qū)綜合檢驗(yàn)檢測中心，山東 青島 266200)

人工合成著色劑具有著色力強(qiáng)、色澤鮮艷、不易褪色、穩(wěn)定性好、易溶解和成本低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品的生產(chǎn)、加工過程中[1-2]. 然而合成著色劑多以苯、甲苯和萘等化工產(chǎn)品為原料, 經(jīng)過磺化、硝化、鹵化、偶氮化等一系列有機(jī)反應(yīng)制成，使得食用色素化學(xué)結(jié)構(gòu)多為偶氮化合物類，它們在體內(nèi)代謝產(chǎn)生β-萘胺和α-氨基-1-萘酚等致癌物，過多食用存在一定的危害性[3-4]. 此外，研究發(fā)現(xiàn)兒童過多攝入著色劑可能會(huì)引起異常行為[5-6]，如日落黃、喹啉黃、偶氮玉紅、誘惑紅、檸檬黃、胭脂紅等6種色素被認(rèn)為可能與兒童多動(dòng)癥有關(guān)[7]. 鑒于合成著色劑的有害性，國家制定了相關(guān)規(guī)定對各類食用色素的最大用量、使用范圍作出說明. 因此對食品中合成著色劑的準(zhǔn)確測定具有重要意義.

目前報(bào)道的有關(guān)食品著色劑檢測方法主要有薄層色譜法[3,8]、高效液相色譜法[5,9]、紫外分光光度法[10]和毛細(xì)管電泳法[11]等. 其中，高效液相色譜法是被廣泛應(yīng)用的測定方法，常用的前處理方法有固相萃取小柱吸附法、聚酰胺吸附法和超聲提取法等. 聚酰胺吸附法是目前國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.35-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定》推薦的著色劑前處理方法. 超聲提取法是SN/T 4457-2016 《出口飲料、冰淇淋等食品中11種合成著色劑的檢測 液相色譜法》所推薦的著色劑前處理方法. 這2種前處理方法在飲料合成著色劑的液相色譜分析中被廣泛應(yīng)用，也各有其優(yōu)缺點(diǎn). 本文對GB 5009.35-2016和SN/T 4457-2016的樣品前處理方法進(jìn)行對比研究，分析其優(yōu)缺點(diǎn)，為日常檢測工作方法的選擇上提供一定的試驗(yàn)依據(jù).

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695液相色譜，超純水制備系統(tǒng)(青島富勒姆科技有限公司)，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，梅特勒FE20型pH計(jì)，恒溫水浴鍋(金怡SHA-C)，Sigma高速離心機(jī)(3-16KL)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮RE-2000).

檸檬黃、胭脂紅、日落黃(壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)，聚酰胺(臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)，乙酸銨(分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)，甲酸(LC-MS級，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，氨水、檸檬酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇、乙酸(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，甲醇、乙腈(色譜純，德國默克).

1.2 試劑配制

乙酸銨溶液(0.02 mol/L)：稱取1.54 g乙酸銨，加水定容至1 000 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后備用. 氨水溶液：量取氨水2 mL，加水定容至100 mL，混勻備用. 30%氨水溶液：量取氨水30 mL，加水定容至100 mL，混勻備用. 甲醇-甲酸溶液：量取甲醇60 mL、甲酸 40 mL，混勻備用. 檸檬酸溶液：稱取檸檬酸20 g，加水定容至100 mL，混勻備用. 無水乙醇-氨水-水溶液：量取無水乙醇 70 mL、上述配制好的氨水溶液20 mL、水10 mL, 混勻備用. pH 6的水：水加檸檬酸溶液調(diào)pH值到6. pH 4的水：水加檸檬酸溶液調(diào)pH值到4.

1.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相：甲醇/0.02 mol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫，洗脫設(shè)置如表1所列. 檢測波長為254 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL.

表1 HPLC梯度洗脫條件Table 1 Conditions of HPLC gradient elution

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的檸檬黃、胭脂紅、日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，加水稀釋配制質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液. 經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，根據(jù)保留時(shí)間和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.5 樣品前處理

1. 5.1 聚酰胺吸附法

按照GB 5009.35-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定》的測定方法處理美年達(dá)橙味飲料，進(jìn)行液相色譜分析.

聚酰胺吸附法：稱取飲料實(shí)際樣品5 g于15 mL樣品管中，超聲驅(qū)除二氧化碳. 樣品溶液加檸檬酸溶液調(diào)pH值至6，加熱至60 ℃，將1 g聚酰胺粉加少許水調(diào)成粥狀，在60 ℃條件下倒入樣品溶液中，攪拌片刻，傾入玻璃層析柱(30 cm×1.5 cm)，用60 ℃ pH為4的水洗滌5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗滌5次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸5次，直至色素完全解吸，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容至5 mL. 經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)高效液相色譜分析.

1.5.2 超聲提取法

按照SN/T 4457-2016 《出口飲料、冰淇淋等食品中11種合成著色劑的檢測 液相色譜法》的測定方法處理美年達(dá)橙味飲料，進(jìn)行液相色譜分析.

超聲提取法：稱取飲料實(shí)際樣品10 g于50 mL樣品管中，用30%氨水溶液調(diào)節(jié)pH值至6，加5%乙腈水溶液定容至50 mL，搖勻，超聲提取30 min，取20 mL混合溶液置入高速離心管中，10 000 r/min，離心10 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)高效液相色譜分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在上述色譜條件下，對配制的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行分析，以各分析物濃度為橫坐標(biāo)，以其相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，各組分的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限如表2所列. 試驗(yàn)結(jié)果表明，檸檬黃、胭脂紅和日落黃3種著色劑在0.1～50.0 μg/mL 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，各組分相關(guān)系數(shù)均在0.999 9以上，根據(jù)儀器的3倍信噪比所對應(yīng)的濃度值確定最低檢出限為0.05 μg/mL，該方法具有低的檢出限.

表2 各組分的保留時(shí)間、線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Retention time, linear range, regression equation, correlation coefficient and detection limits of synthetic colorants

2.2 兩種樣品前處理方法對著色劑含量分析比較

按照GB 5009.35-2016和SN/T 4457-2016的2種樣品前處理方法，對實(shí)際樣品(美年達(dá)橙味飲料，市售)進(jìn)行前處理，高效液相色譜分析，結(jié)果如圖1所示. 從圖1中可以看出，樣品通過上述2種不同方法進(jìn)行前處理后分析，都檢測到了檸檬黃、胭脂紅和日落黃, 具體數(shù)據(jù)如表3所列. 由表3可見，2種前處理方法的試驗(yàn)結(jié)果無顯著差異，且均具有較好的重現(xiàn)性.

圖1 檸檬黃、胭脂紅、日落黃液相色譜圖(a)標(biāo)準(zhǔn)樣品(10 μg/mL)，(b)超聲提取法，(c)聚酰胺吸附法(1)檸檬黃，(2)胭脂紅，(3)日落黃Fig.1 Eluent chromatograms of citrine, carmine and sunset yellow(a) chromatogram of standard sample (10 μg/mL)，(b) ultrasonic extraction method，(c) polyamide adsorption method(1) Citrine，(2) Carmine, (3) Sunset yellow

聚酰胺吸附法利用聚酰胺在弱酸性條件下與色素吸附而在堿性條件與色素解吸的原理對色素進(jìn)行富集. 樣品在加入聚酰胺之前，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值至6，樣品溶液加熱后，加入聚酰胺攪拌吸附色素，并經(jīng)過多次水洗、酸洗除去雜質(zhì)后，進(jìn)而水洗至中性，用氨堿性乙醇解吸色素，整個(gè)過程尤其是水洗至中性過程耗時(shí)長. 此外，經(jīng)過多次水洗、酸洗過程雜質(zhì)干擾少，體現(xiàn)在色譜圖中基線干凈(圖1c). 相比較，超聲提取法調(diào)節(jié)pH值至6后，只需加入5%乙腈水溶液定容，超聲、離心后直接進(jìn)樣分析，整個(gè)過程相比聚酰胺吸附法明顯的縮短了分析時(shí)間，但是從色譜圖(圖1b)可以看出雜質(zhì)峰干擾較多.

2.3 兩種前處理方法回收率

在美年達(dá)橙味飲料樣品中，分別加入0.5、5、20 mg/kg 的檸檬黃、胭脂紅、日落黃的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按照以上2 種前處理方法進(jìn)行樣品前處理，液相色譜測定，計(jì)算回收率，結(jié)果如表4所列. 聚酰胺吸附法測定的被測樣品加標(biāo)回收率在83.8%～105.5%之間，超聲提取法測定的被測樣品加標(biāo)回收率在90.2%～107.2%之間，試驗(yàn)結(jié)果表明2種前處理方法的回收率結(jié)果令人滿意.

表3 飲料中著色劑測定結(jié)果的比較Table 3 Determination results of synthetic colorants in beverages

表4 兩種前處理方法的各組分回收率(n=3)Table 4 Recovery rate of each component of two pretreatment methods

3 結(jié)論

分別采用聚酰胺吸附法和超聲提取法對飲料中的著色劑進(jìn)行提取，結(jié)合高效液相色譜分析，測定美年達(dá)飲料中檸檬黃、胭脂紅、日落黃的含量. 試驗(yàn)結(jié)果表明，2種樣品前處理方法對美年達(dá)橙味飲料中著色劑的測定結(jié)果無顯著差異，且均具有較好的重現(xiàn)性和回收率. 通過聚酰胺吸附法處理的樣品，雜質(zhì)干擾峰少，色譜峰基質(zhì)干凈，但是操作較為復(fù)雜，適用于小批量樣品的定量檢測. 超聲提取法操作簡單、成本低廉，大大縮短了分析時(shí)間，適用于大批量樣品的定量檢測，但也存在其他雜質(zhì)峰的干擾. 因此，對于飲料中著色劑檢測可根據(jù)需求選擇合適的樣品前處理方法.

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