蔡 樂(lè)，朱 英，張明華，陳靜靜，柴 棟（解放軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100853）

左乙拉西坦（levetiracetam，LEV）是一種吡咯烷酮衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與其他抗癲癇藥物無(wú)相關(guān)性。LEV的抗癲癇機(jī)制尚不明確，有研究[1]發(fā)現(xiàn)其可與突觸囊泡蛋白2A結(jié)合并抑制突觸前膜鈣通道，可能有選擇性地抑制癲癇樣突發(fā)放電的超同步性和癲癇發(fā)作傳播的作用。LEV可用于成人、兒童及一個(gè)月以上嬰幼兒癲癇部分性發(fā)作的加用治療。LEV具有良好的藥動(dòng)學(xué)特性，其生物利用度高，蛋白結(jié)合率較低（＜ 10%），呈線性代謝特征，無(wú)肝酶誘導(dǎo)作用[2]。由于大部分LEV（約66%）以原型經(jīng)腎臟排泄[3]，腎功能異常以及聯(lián)合使用主要經(jīng)腎臟排泄的藥物可能會(huì)減慢其在體內(nèi)的消除。因此對(duì)于特殊人群（如兒童、老年人、孕婦和腎功能不全患者）使用LEV后進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)可能有利于患者的個(gè)體化治療，提高患者用藥依從性。為此，本研究建立了人血漿中LEV的HPLC測(cè)定方法，旨為臨床優(yōu)化LEV的給藥方案提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

左乙拉西坦對(duì)照品（S i g m a公司，批號(hào)：BCBS2739V），甲硝唑片（遠(yuǎn)大醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：170216）。乙腈為色譜純（Fisher公司），甲醇、二氯甲烷為色譜純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為實(shí)驗(yàn)用超純水。

1.2 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（包括在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、色譜工作站，美國(guó)Agilent公司）；TGL16M型醫(yī)用離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海弛唐實(shí)業(yè)有限公司）；AG-285型電子天平（瑞士Mettler公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，Thermo公司）；流動(dòng)相：水-乙腈（87 : 13，v/v）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 樣品處理

2.2.1 血漿樣品處理方法精密吸取待測(cè)血漿400μL置于1.5 mL帶塞塑料離心試管，加入內(nèi)標(biāo)（200 μg·mL-1的甲硝唑溶液）50 μL，再加入600 μL乙腈，渦旋振蕩1 min，12 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液900 μL于1.5 mL帶塞塑料離心試管；加入二氯甲烷400 μL，渦旋振蕩1 min，12 000 r·min-1離心5 min；吸取上清液200 μL于樣品瓶中（注意不要觸及下層有機(jī)相），20 μL進(jìn)樣分析。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱(chēng)取左乙拉西坦對(duì)照品，用甲醇溶解配制成含左乙拉西坦為1.0 mg·mL-1的LEV儲(chǔ)備液；取適量LEV儲(chǔ)備液用空白血漿分別配制濃度為80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 μg·mL-1的LEV血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理和進(jìn)樣測(cè)定。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰高比（PHR）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行加權(quán)線性回歸計(jì)算。

2.2.3 質(zhì)控樣品取適量LEV儲(chǔ)備液用空白血漿另行配制濃度為5.0、25.0和50.0 μg·mL-1三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品溶液。將質(zhì)控樣品作為“未知樣品”隨機(jī)分散于血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液和每批待測(cè)樣品中測(cè)定。以每次的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出質(zhì)控樣品的濃度，以質(zhì)控樣品的測(cè)定濃度與標(biāo)示濃度的比值考核方法學(xué)的精密度、重現(xiàn)性和回收率。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度

取3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各5份，組成一個(gè)分析批，按“2.2.1”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定，計(jì)算批內(nèi)RSD；連續(xù)3 d，運(yùn)行3個(gè)分析批的質(zhì)控樣品，考察批間RSD；各濃度質(zhì)控樣品按未知樣品隨標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)測(cè)定，計(jì)算方法學(xué)回收率。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，置于– 20 ℃冰箱，經(jīng)反復(fù)凍融3次，測(cè)定前放置室溫平衡后，按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理和進(jìn)樣，以此考察樣品凍融穩(wěn)定性；取質(zhì)控樣品于室溫放置24 h，依“2.2.1”項(xiàng)下方法處理，考察樣品室溫放置穩(wěn)定性；取質(zhì)控樣品，依照“2.2.1”項(xiàng)下方法處理后室溫放置，于0、1、3、6、12、24 h測(cè)定，考察樣品處理后放置穩(wěn)定性。

3 結(jié)果

3.1 色譜行為

由圖1可見(jiàn)，在205 nm波長(zhǎng)下，樣品圖譜在LEV和內(nèi)標(biāo)出峰處背景干凈，無(wú)明顯雜峰干擾；LEV與內(nèi)標(biāo)峰形尖銳，與各雜峰分離良好。LEV與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為4.7 min和5.2 min。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

3.2 線性關(guān)系

在本方法條件下，LEV在2.5 ～ 80.0 μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性方程為：PHR= 0.114 1C+ 0.115 3，r= 0.999 4。

3.3 精密度與方法學(xué)回收率

本方法的精密度和方法學(xué)回收率結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果表明本方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表1 方法精密度和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1 The precision and recovery results of the method

3.4 穩(wěn)定性考察結(jié)果

穩(wěn)定性結(jié)果表明，LEV質(zhì)控樣品經(jīng)反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性良好；LEV血漿樣品室溫放置24 h穩(wěn)定；LEV血漿樣品處理后，室溫放置24 h穩(wěn)定。

4 討論

4.1 測(cè)定方法與線性范圍的確定

文獻(xiàn)報(bào)道，LEV治療藥物監(jiān)測(cè)的方法有多種，包括HPLC、HPLC-MS/MS、免疫分析法等[4-7]。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)市售的免疫學(xué)試劑盒方法監(jiān)測(cè)LEV血藥濃度，因HPLC的普及性較好，為此本研究建立了LEV的HPLC測(cè)定方法。有報(bào)道LEV的有效濃度范圍為12 ～46 μg·mL-1[2-3]，本研究將線性范圍設(shè)定為2.5 ～ 80.0 μg·mL-1，可涵蓋此濃度范圍，以滿(mǎn)足臨床日常監(jiān)測(cè)LEV血藥濃度的需要。

4.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相溶液pH與乙腈比例對(duì)LEV保留時(shí)間和分離的影響，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中乙腈比例對(duì)LEV和內(nèi)標(biāo)甲硝唑保留時(shí)間的影響較大，隨著乙腈比例的升高，LEV和甲硝唑保留時(shí)間明顯縮短。流動(dòng)相溶液pH值雖然對(duì)LEV和甲硝唑的保留時(shí)間影響不大，但由于血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)的存在，使用磷酸鹽緩沖液和乙腈為流動(dòng)相時(shí)，LEV和甲硝唑受到了雜峰的干擾。為提高檢測(cè)效率，縮短測(cè)定時(shí)間，經(jīng)優(yōu)化最終確定以水-乙腈（87 : 13，v/v）作為流動(dòng)相。

4.3 樣品處理方法的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道，LEV測(cè)定時(shí)可選用液-液萃取和蛋白沉淀的方法處理血漿樣品[5,8-9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白沉淀方法操作較為簡(jiǎn)便、省時(shí)。在乙腈沉淀蛋白后，使用二氯甲烷或氯仿可將乙腈反提，除去脂溶性雜質(zhì)，可進(jìn)一步減少內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾并提高方法的靈敏度。本實(shí)驗(yàn)分別考察了二氯甲烷和氯仿反提取乙腈的效果，發(fā)現(xiàn)使用二氯甲烷優(yōu)于氯仿。為此，本研究對(duì)原有蛋白沉淀處理方法進(jìn)行改進(jìn)，以乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷反提取去雜質(zhì)的方法處理血漿樣品。

4.4 樣品穩(wěn)定性的考察

本實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，LEV在血漿中室溫放置24 h穩(wěn)定，經(jīng)反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性良好。有報(bào)道顯示LEV的全血樣品在體外可經(jīng)酯酶水解[3]，因此提示臨床在采血后應(yīng)盡快分離出LEV血漿樣品，以減少全血樣品水解而導(dǎo)致藥物濃度降低。

綜上，根據(jù)文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)室客觀條件，本研究建立了靈敏度高、簡(jiǎn)便易行的測(cè)定血漿中LEV的HPLC方法，為L(zhǎng)EV血藥濃度監(jiān)測(cè)提供方法學(xué)基礎(chǔ)，為臨床根據(jù)血藥濃度調(diào)整給藥方案，促進(jìn)合理用藥提供依據(jù)。

[1] 章悅，朱國(guó)行.抗癲癇新藥[J].上海醫(yī)藥，2015，36（9）：8-12.

[2] Jacob S, Nair AB. An updated overview on therapeutic drug monitoring of recent antiepileptic drugs[J]. Drugs R D, 2016,16(4): 303-316.

[3] Patsalos PN, Berry DJ, Bourgeois BF,et al. Antiepileptic drugs— best practice guidelines for therapeutic drug monitoring:a position paper by the subcommission on therapeutic drug monitoring, ILAE commission on therapeutic strategies[J].Epilepsia, 2008, 49(7): 1239-1276.

[4] 謝吉科，姜德春.治療藥物監(jiān)測(cè)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2011，8（6）：379-382.

[5] Engelbrecht L, Grobler CJ, Rheeders M. A simple and costeffective HPLC-UV method for the detection of levetiracetam in plasma/serum of patients with epilepsy[J]. Biomed Chromatogr,2017, 31(10): e3969.

[6] Carlow DC, Shi H, Schof i eld RC. Simultaneous quantitation of lamotrigine, levetiracetam, 10-hydroxycarbazepine, topiramate,and zonisamide in serum using HPLC-MS/MS[J]. Methods Mol Biol, 2016, 1383: 29-37.

[7] Bianchi V, Arfini C, Vidali M. Therapeutic drug monitoring of levetiracetam: comparison of a novel immunoassay with an HPLC method[J]. Ther Drug Monit, 2014, 36(5): 681-685.

[8] 王穎慧，魏吉敏，王云秀，等.高效液相色譜法測(cè)定左乙拉西坦血藥濃度[J].兒科藥學(xué)雜志，2010，16（4）：34-36.

[9] 李惠芬，張玉琴，劉彥.HPLC法測(cè)定人血清中左乙拉西坦的濃度[J].中國(guó)藥房，2013，24（14）：1272-1274.