劉 飛，任安書，葛 萍，丁年芳，娜仁·琪琪格

(南京華譜分析檢測技術服務有限公司，江蘇 南京 210001)

圖1 4種黃曲霉毒素的結構Fig.1 Chemical structures of the four aflatoxins

黃曲霉毒素是一類化學結構類似的二氫呋喃香豆素衍生物，為黃曲霉菌和寄生曲霉菌等真菌經(jīng)過聚酮途徑產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是一種天然存在的毒性極強的劇毒物質(zhì)，并具有致突變、致畸形和致癌作用。1993年，黃曲霉毒素 B1就已被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的癌癥研究機構認定為Ⅰ類致癌物[1-2]。研究表明:黃曲霉毒素B1的毒性為氰化鉀的10倍,砒霜的68倍[3]；且其致癌性是二甲基亞硝胺的70倍[4]。黃曲霉毒素是飼料中最常見的真菌毒素，因在自然條件下，玉米、花生、大米等糧食未能及時曬干或儲藏不當受污染而產(chǎn)生。黃曲霉毒素嚴重威脅了飼料和食品的消費安全。天然產(chǎn)生的黃曲霉毒素根據(jù)化學結構不同主要包括黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2) 4種，其結構式如圖1所示。

飼料中黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法[5]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[6-8]、液相色譜法[9-10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]等。其中，薄層色譜法是測定飼料中黃曲霉毒素的傳統(tǒng)方法之一，該方法對檢測的規(guī)范和熟練程度要求較高，準確度較低，重現(xiàn)性較差[14]；ELISA方法會對黃曲霉毒素及其類似物產(chǎn)生一定的交叉反應，可能產(chǎn)生假陽性或者假陰性的結果；液相色譜法檢測黃曲霉毒素一般采用熒光檢測器柱后衍生法，但該方法的檢出限較高，且檢測時間長；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法比液相色譜法具有更高的靈敏度和準確性，但可能存在基質(zhì)抑制效應的影響。因此，建立一種簡單、快速、準確度高的測定飼料中黃曲霉毒素的檢測方法勢在必行。

樣品前處理是準確、有效測定黃曲霉毒素的基礎，尤其是對于基質(zhì)復雜的飼料樣品，它甚至成為制約整個分析過程的決定性因素。本實驗采用在線固相萃取富集技術，將飼料樣品直接進樣，通過優(yōu)化在線富集條件和液相色譜-質(zhì)譜條件，采用高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法進行分析，減少了人工操作的不確定因素，提高了方法的重現(xiàn)性，顯著縮短了飼料樣品的前處理時間。本方法具有前處理簡便、分析時間短、測定結果準確、自動化程度高等特點，可用于飼料樣品中黃曲霉毒素的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive(賽默飛世爾科技公司)，配HESI-Ⅱ源，Spark SymbiosisTM在線固相萃取-液相色譜系統(tǒng)( Spark Holland，荷蘭),包括系統(tǒng)自動進樣器模塊、二元高效液相色譜泵、SPE在線固相萃取儀(含溶劑混合高壓注射泵和小柱接夾組件)柱溫箱模塊；高純水發(fā)生器(英國ELGA公司)；XW-80A型渦旋混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠)；AFB1、AFB2、AFG1和AFG2(純度≥99%，Sigma公司)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；乙酸銨、甲酸(分析純，南京化學試劑有限公司)。

1.2 標準溶液的配制

分別稱取AFB1、AFB2、AFG1和AFG2標準品各10 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 g/L的標準儲備液，密封保存于4 ℃冰箱中。準確吸取1 g/L的4種單標準儲備液各1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容得100 mg/L的混合標準溶液。根據(jù)需要，吸取一定量的標準溶液，用初始流動相將混合標準溶液稀釋成系列標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入1 g NaCl和20 mL乙腈-水(80∶20，體積比)，溶解后，超聲提取20 min，于8 000 r/min離心5 min，吸取乙腈層，用20 mmol/L乙酸銨溶液(pH 6.80～7.05)稀釋10倍后進樣；供高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀測定。

表1 固相萃取程序Table 1 Procedure of solid phase extraction

1.4 在線固相萃取條件

在線固相萃取柱為IMMUNOPREP?ONLINE AFLATOXIN(Part Code:P900)，上樣(活化)液：20 mmol/L乙酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH值至6.80～7.00；淋洗液：含6%甲醇的20 mmol/L乙酸銨溶液,調(diào)至pH 8.30～8.50；洗脫液：含50 mmol/L乙酸銨的75% 甲醇水溶液，調(diào)至pH(2.00±0.05)；稀釋液：20 mmol/L乙酸銨溶液，調(diào)至pH 6.80～7.05；在線固相萃取程序如表1所示。

1.5 液相色譜條件

色譜分析柱為Diamonsil Plus(150 mm ×4.6 mm,5 μm);流動相為20 mmol/L 乙酸銨水溶液(A)-甲醇(B);流速0.70 mL/min；進樣量10 μL；樣品室溫度25 ℃。色譜梯度洗脫程序為：0～2.00 min，95%A；2.00～2.05 min，95%～75%A；2.05～6.00 min，75%～5%A；6.00～8.00 min，5%A;8.00～8.05 min，5%～95%A；8.05～10.00 min，95%A。

1.6 質(zhì)譜條件

可加熱的電噴霧離子源(HESI-Ⅱ)；毛細管溫度為350 ℃，鞘氣(N2)流速50 L/min，輔助氣(N2)流速6 L/min，吹掃氣(N2)流速3 L/min；噴霧電壓為3 kV，透鏡電壓為50 V；采用正離子掃描模式；全掃描的分辨率R=35 000，掃描范圍：100～500m/z。

2 結果與討論

2.1 固相萃取柱與分析柱的選擇

由于黃曲霉毒素在飼料中含量較低，直接進樣分析需增大進樣體積方能檢出，但可能會超出色譜柱的承受范圍，導致色譜柱壽命縮短，另一方面飼料中存在大量的礦物質(zhì)、淀粉、蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，國標GB/T 30955-2014中對黃曲霉毒素的檢出限較高，必須進行富集。在AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的分析前處理中，為提高目標化合物的分析效果，多選用免疫親和柱作為分析小柱[15-17]，因此本實驗選用拜發(fā)公司生產(chǎn)的免疫親和柱作為樣品前處理固相萃取小柱；黃曲霉毒素在反相液相色譜柱上保留能力較強，選用C18基質(zhì)的色譜柱作為分析柱，以乙酸銨水溶液和甲醇作為洗脫液進行梯度洗脫。固相萃取柱和分析柱具有一定的正交性，可降低分析柱分析結果的干擾[18]。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

本研究采用XLC分析模式，系統(tǒng)通過自動進樣器采樣后，經(jīng)閥切換樣品上樣到活化的SPE小柱中，經(jīng)固相萃取淋洗后，通過閥切換全量在線洗脫到LC分析柱上，然后進行液相分離-質(zhì)譜分析。

以AFB1為靶標物質(zhì)，本實驗比較了以下3種前處理方式對回收率的影響。

①稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水(1∶1，體積比)溶解，加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋后，于8 000 r/min離心5 min，吸取1 mL乙腈層，用20 mmol/L乙酸銨溶液(pH=6.80～7.05)定容至10 mL；

②稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水(80∶20，體積比)溶解，于8 000 r/min離心5 min，吸取1 mL乙腈層，用20 mmol/L乙酸銨溶液(pH=6.80～7.05)定容至10 mL；

③稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入1 g NaCl，經(jīng)20 mL乙腈-水(80∶20)溶解，超聲提取后，于8 000 r/min離心5 min，吸取1 mL乙腈層，用20 mmol/L乙酸銨溶液(pH=6.80～7.05)定容至10 mL。

表2 3種前處理方法對樣品加標回收率的影響Table 2 Influences of three pretreatment methods on recoveries of the sample

圖2 50 μg/kg黃曲霉毒素標準溶液的提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of 50 μg/kg standard solution

結果表明：方法①的基質(zhì)效應偏高，方法②和方法③的回收率明顯優(yōu)于方法①(見表2)。但在實際操作中發(fā)現(xiàn)，方法②中有些樣品存在沉淀不徹底的現(xiàn)象，而方法③中NaCl的加入有助于雜質(zhì)沉淀，使樣品澄清，進樣時不堵塞SPE柱，同時有利于延長SPE柱的使用壽命，因此選用方法③作為樣品前處理方法。

2.3 在線固相萃取條件的優(yōu)化

考慮到4種黃曲霉毒素從固相萃取小柱上洗脫，若與分析柱的流動相不一致，可能導致色譜峰拖尾。因此，確定分析柱的流動相和固相萃取柱的洗脫流動相均為乙酸銨和甲醇兩種溶劑。通過調(diào)節(jié)甲醇-乙酸銨溶液的梯度比例，可將靶標物質(zhì)與雜質(zhì)分離。

在線固相萃取法處理樣品包括3 個步驟:①樣品組分由進樣器與SPE 泵流動相引入到SPE 柱進行富集，干擾物(或基質(zhì))則從柱上流出并排至廢液收集器，同時分析物黃曲霉毒素保留在SPE 柱上，分析柱處于清洗與平衡的過程;②通過閥切換，將4種靶標物質(zhì)由SPE 柱轉(zhuǎn)移至分析柱;③閥切換到初始位置，靶標物質(zhì)在分析柱上保留洗脫，同時SPE 柱進行離線清洗和平衡，為下一針進樣準備[19]。因此，閥切換時間和轉(zhuǎn)移過程是在線固相萃取的核心步驟，本實驗對標準品進行優(yōu)化，以4種黃曲霉毒素均在質(zhì)譜上提取出完整譜峰為依據(jù)，確定閥切換時間為2.6 min；SPE柱選擇含50 mmol/L乙酸銨的75% 甲醇水溶液作為洗脫溶劑，將SPE柱吸附的4種靶標物質(zhì)洗脫下來，同時將靶標物質(zhì)保留在分析柱上，采用HPD共聚焦洗脫模式，確保所有靶標物質(zhì)洗脫完全，提取質(zhì)量數(shù)范圍為10 ppm時4種黃曲霉毒素的提取離子流圖如圖2所示。

2.4 線性范圍與定量下限

在優(yōu)化條件下，對質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2標準品進行分析。以黃曲霉毒素特征離子的色譜峰面積為縱坐標(y)、相應含量為橫坐標(x,μg/L)，繪制標準曲線，得到線性回歸方程。由表3可知，4種黃曲霉毒素的相關系數(shù)(r)大于0.99，在0.5～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好。分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)時對應的濃度為方法的檢出限和定量下限，結果如表3所示。由表3可知，本方法對AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的檢出限為0.2 μg/kg，定量下限為0.5 μg/kg。

2.5 回收率與相對標準偏差

分別在濃縮飼料和發(fā)酵豆粕中添加0.5、1.0、5.0 μg/kg 3個水平的4種黃曲霉毒素標準品進行加標回收實驗，每個水平平行測定5次，考察方法的回收率與精密度(見表4)。結果表明，4種目標化合物在飼料中的回收率為94.6%～114.3%，相對標準偏差(RSD)不大于8.3%。本方法的準確性較好，可用于實際飼料樣品中4種黃曲霉毒素的檢測。

表3 4種黃曲霉毒素的精確質(zhì)量數(shù)、線性方程、相關系數(shù)、保留時間、檢出限及定量下限Table 3 Accurate masses,regression equations,correlation coefficients(r),retention times,limits of detection(LOD,n=7) and limits of quantitation(LOQ,n=7) of AFB1,AFB2,AFG1 and AFG2

表4 飼料中4種黃曲霉毒素的加標回收率與相對標準偏差(n=5)Table 4 Recoveries and RSDs of AFB1，AFB2，AFG1 and AFG2 spiked in feeds(n=5)

圖3 空白樣品中加入黃曲霉毒素標準溶液(0.5 μg/kg)的提取離子流色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms from blank sample spiked standard solution(0.5 μg/kg)

2.6 實際樣品的檢測

運用本研究建立的方法，在上述測定條件下對30個進口飼料樣品(包括寵物飼料、豆粕、濃縮飼料、配合飼料、發(fā)酵豆粕等)中4種黃曲霉毒素進行定性和定量分析，結果顯示，30個樣品均未檢出AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。其中，空白飼料中加入黃曲霉毒素標準溶液的提取離子流圖如圖3所示，可以看出，基質(zhì)對4種化合物的分離分析無影響，本方法對飼料的測定準確、可靠。

2.7 與離線固相萃取/液相色譜-質(zhì)譜方法的比較

與離線固相萃取/液相色譜-質(zhì)譜法測定飼料中的4種黃曲霉毒素進行比較[20]，本研究采用的自動化控制在線固相萃取方法，具有操作簡單、整體分析時間短、全自動分析的特點。本方法的SPE柱理論上可進行100次飼料樣品的分析，大大節(jié)約了檢測成本。而且本方法通過閥切換技術和HPD共聚焦洗脫模式，使得樣品中的大部分雜質(zhì)可以直接流入廢液中，僅靶標物質(zhì)進入分析柱，從而延長了分析柱的使用壽命。此外，在線SPE方法的精密度更高，減少了人工操作的不確定性。

3 結 論

本研究通過閥切換技術將固相萃取與高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜相結合，建立了在線固相萃取直接測定飼料中黃曲霉毒素的方法。樣品經(jīng)溶解、超聲提取、稀釋后直接進樣測定，自動實現(xiàn)了靶標物質(zhì)的在線富集和干擾雜質(zhì)的在線去除。應用本方法可在13 min內(nèi)完成整個檢測過程，大大提高了檢測效率。且該方法操作簡單，能夠滿足飼料中4種黃曲霉毒素的分析要求。

參考文獻：

[1] Egner P A,Wang J B,Zhu Y R.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),2001,98(25):14601-14606.

[2] Ren Y P,Zhang Y,Shao S L,Cai Z X,Feng L,Pan H F,Wang Z G.J.Chromatogr.A,2007,1143(1/2):48-64.

[3] Shyu R H,Shyu H F,Liu H W,Tang S S.Toxicon,2002,40(3):255-258.

[4] Papp E,H-Otta K,Záray G,Mincsovics E.Microchem.J.,2002,73(1/2):39-46.

[5] GB/T 8381-2008.Method for the Determination of Aflatoxin B1 in Feed——Semi-quantitative Thin Layer Chromatography.National Standards of the People’s Republic of China(飼料中黃曲霉毒素B1的測定 半定量薄層色譜法.中華人民共和國國家標準).

[6] Sun Q,Li G F,Deng Q M,Liu J M,Shi G Q.Environ.Chem.(孫清，李谷豐，鄧乾民，劉杰民，石國慶.環(huán)境化學)，2015,34(10)：1845-1853.

[7] Li M,Ma F,Li P W,Zhang Q,Zhang W,Zhou H Y,Yin N R,Wang H L,Wu H.Chin.J.OilCropSci.(李敏，馬飛，李培武，張奇，張文，周海燕，印南日，王恒玲，吳慧.中國油料作物學報)，2014,36(6)：802-807.

[8] Li H Q,Yu D W,Liu Z N,Li X,Xie X,Liu X C,Zhao Y,Song X D,Liu P P.FoodRes.Dev.(李海礁，喻東威，劉志楠，李欣，解鑫，劉曉川，趙媛，宋曉東，劉萍萍.食品研究與開發(fā))，2013,34(21)：83-85.

[9] Li L,Li R,Xie G,Ye J,Wang S X.J.Instrum.Anal.(李麗，黎睿，謝剛，葉金，王松雪.分析測試學報)，2017,36(6)：800-804.

[10] GB/T 30955-2014.Method for the Determination of Aflatoxin B1,B2,G1,G2 in Seed Immunoaffinity Column Purification——High Performance Liquid Chromatography.National Standards of the People’s Republic of China(飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定 免疫親和柱凈化——高效液相色譜法.中華人民共和國國家標準).

[11] NY/T 2071-2011.Method for the Determination of Aflatoxins,Zearalenone and T-2 Toxins in Feed-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry.Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China(飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2 毒素的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部標準).

[12] Wang S M,Xu Y,Mao D,Zheng R,Wang K,Ji S.J.Pharm.Anal.(王少敏，許勇，毛丹，鄭榮，王柯，季申.藥物分析雜志)，2011,31(5)：907-911.

[13] Wang X P,Li P W,Yang Y,Zhang W,Zhang Q,Fan S F,Yu L,Wang L,Chen X M,Li Y,Jiang J.Chin.J.Chromatogr.(王秀嬪，李培武，楊揚，張文，張奇，范素芳，喻理，王琳，陳小媚，李英，姜俊.色譜)，2011,(6)：517-522.

[14] Liu L X,Zhang L,Xiang Y E,Huang Z W,Li H B,Cui J.LivestockFeedSci.(劉利曉，張亮，向艷娥，黃志偉，李洪波，崔佳.畜牧與飼料科學)，2016,37(3)：33-35.

[15] Han S,Liu Y,Lü M L,Li J Z,Wang J.Chin.J.Chromatogr.(韓深，劉螢，呂美玲，李建中，王金.色譜)，2011,23:613-617.

[16] Sun X,Xi C X,Tang B B,Wang G M,Chen D D,Zhao H.Chin.J.Anal.Chem.(孫雪，郗存顯，唐柏彬，王國民，陳冬東，趙華.分析化學)，2016,44(6)：970-978.

[17] Li J,Yu Y M,Tian M,Wang H W,Wei F,Li L,Wang X.Chin.J.Chromatogr.(李軍，于一茫，田苗，王宏偉，衛(wèi)鋒，李莉，王雄.色譜)，2006,24(6)：581-584.

[18] Shen G H,Guo L P,Liu L S,Zhang W Y,Liu X D.Chin.J.Anal.Chem.(沈廣虎，郭麗萍，劉利盛，張文英，劉曉達.分析化學)，2014,42(12)：1823-1827.

[19] Jia P Y,Zeng M F,Feng N J,Zheng D F,Sun F D,Sun R,Li C Y.Chin.J.Anal.Chem.(賈鵬禹，曾明飛，馮乃杰，鄭殿峰，孫福東，孫蕊，李朝陽.分析化學)，2014,42(12)：1743-1749.

[20] Zhu C Y,Ying Y F,Wei M Y,Chen H H,Lu C B,Zhou W H,Lin X J,Luo C J.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(朱聰英，應永飛，韋敏鈺，陳慧華，陸春波，周文海，林仙軍，羅成江.質(zhì)譜學報)，2010,31(4)：240-246.