王大紅， 張帥瀅， 宋鵬輝， 張 穎， 孫建瑞

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院/微生物資源開發(fā)與利用實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471023)

板栗(Chestnut) 素有“干果之王”、“木本糧食”之稱，主要分布于中國大陸、越南及臺(tái)灣地區(qū)[1]，栗果富含淀粉及蛋白質(zhì)，具有養(yǎng)胃健脾，延緩人體衰老等功能[2]。板栗在貯藏和運(yùn)輸期間，極易生蟲、失水、腐爛、發(fā)芽等，損失率約為30%[3]。在貯存期間造成板栗損失的主要原因有：一是象鼻蟲的寄生，在板栗生長期間侵入板栗內(nèi)部，最終導(dǎo)致蟲害[4]；二是微生物侵襲導(dǎo)致板栗仁腐爛，主要是真菌[5]；三是水分蒸發(fā)，導(dǎo)致果仁干縮；四是植物呼吸導(dǎo)致的衰老[6]。因此，板栗不易儲(chǔ)存，保鮮難度較大。目前，板栗的保鮮主要采用防腐處理、涂膜和輻射處理等方法[7-8]，在防腐處理方面，采用水楊酸、焦亞硫酸鈉等化學(xué)防腐劑的較多，而采用生物防腐劑的較少[9]。

納他霉素(Natamycin)是由納塔爾鏈霉菌等放線菌產(chǎn)生的一種能有效抑制真菌生長和真菌毒素產(chǎn)生的多烯類抗生素，因其高效、安全，已被世界上大多數(shù)國家批準(zhǔn)用做食品防腐劑[10]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在乳制品、肉類、水果和飲料上[11]。本試驗(yàn)采用納他霉素復(fù)合涂膜劑處理板栗，研究在保鮮過程中板栗的品質(zhì)變化，為延長板栗的保藏期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

板栗為河南省信陽市豫羅紅板栗。

納他霉素、乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸由浙江新銀象生物工程有限公司生產(chǎn)；山梨酸鉀，上海藍(lán)季科技有限公司產(chǎn)品；普魯蘭多糖，百納食品配料有限公司產(chǎn)品；水溶性大豆多糖，河南正順生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋，北京科偉儀器有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司產(chǎn)品；UV-2600紫外分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 防腐劑的篩選 把板栗隨機(jī)分為6組，每組3 kg，每組設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，采用0.3 g/kg納他霉素; 0.3 g/kg納他霉素+0.5 g/kg山梨酸鉀；0.3 g/kg納他霉素+0.5 g/kg苯甲酸鈉；0.3 g/kg納他霉素+0.2 g/kg乳酸鏈球菌素；0.3 g/kg納他霉素+0.2 g/kgε-聚賴氨酸作為單一和復(fù)合防腐劑進(jìn)行噴灑處理，晾干后放入有孔氯乙烯塑料袋內(nèi)， 15 ℃恒溫箱中保存60 d后統(tǒng)計(jì)腐爛率。

1.3.2 板栗涂膜劑的篩選 選取普魯蘭多糖、水溶性大豆多糖、殼聚糖、甲基纖維素和大豆分離蛋白作為涂膜劑，按每1 kg板栗加入10 g涂膜劑的比例，分別與篩選的防腐劑混合噴灑，晾干后放入有孔氯乙烯塑料袋內(nèi)，15 ℃恒溫箱中保存60 d后統(tǒng)計(jì)質(zhì)量損失率。

1.3.3 保鮮試驗(yàn) 將板栗隨機(jī)分為12組，每組3 kg，每組設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，將板栗采用復(fù)合防腐劑處理，然后放入有孔聚氯乙烯塑料袋內(nèi)，15 ℃保存90 d，每15 d 取樣測定板栗多糖、PPO、POD和PAL等相關(guān)生理指標(biāo)。貯存結(jié)束后，測定板栗的質(zhì)量損失率、腐爛率。

1.3.4 質(zhì)量損失率的測定 質(zhì)量損失率計(jì)算公式：質(zhì)量損失率=(每組板栗損失的質(zhì)量/保存前板栗總質(zhì)量) ×100%

1.3.5 腐爛率的測定 腐爛率計(jì)算公式：腐爛率=(腐爛果數(shù)/總果數(shù)) ×100%

1.3.6 板栗中多糖含量的測定 采用蒽酮-硫酸比色法測定板栗中多糖含量[12]。

1.3.7 過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的測定 酶液制備：板栗果肉切碎，取2 g放入研缽中，加20 ml的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH=6.8)，在冰浴中研磨成漿，以10 000 r/min冷凍離心15 min，上清液即為待測酶液。

過氧化物酶活性的測定：采用愈創(chuàng)木酚法[13]。將0.2 ml 酶液加入1 ml 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液，30 ℃水浴5 min，加入1 ml 2% H2O2溶液，以經(jīng)過沸水處理的酶液為對(duì)照。加入酶液，每隔0.5 min在波長為470 nm處測定吸光度，吸光度每1 min增大0.001為1個(gè)POD活力單位，以此計(jì)算板栗中POD酶活性。

多酚氧化酶活性的測定：采用鄰苯二酚法[14]。將0.2 ml 酶液加入2 ml 0.5 mol/L鄰苯二酚溶液，30 ℃水浴5 min，以經(jīng)過沸水處理的酶液為對(duì)照。加入酶液，每隔0.5 min測定波長為410 nm的吸光度，吸光度每1 min增大0.001為1個(gè)PPO活力單位，以此計(jì)算板栗中PPO酶活性。

1.3.8 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定 酶粗提液的制備：板栗果肉1 g，加20 ml 5 mmol/L的巰基乙醇的硼酸緩沖液、0.5 g聚乙烯吡咯烷酮，在冰浴中研磨成漿，10 000 r/min冷凍離心15 min，上清液稀釋4倍即為反應(yīng)酶液。

酶活性測定[15]：1 ml酶液加1 ml 0.02 mol/L 苯丙氨酸和2 ml蒸餾水，反應(yīng)在30 ℃水浴中進(jìn)行，每隔0.5 h測定波長為290 nm的吸光度，對(duì)照組以蒸餾水代替苯丙氨酸。吸光度每1 h增大0.01為1個(gè)PAL酶活單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，采用Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗防腐劑的篩選與優(yōu)化

根據(jù)《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760-2014)規(guī)定，納他霉素、乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸、山梨酸鉀和苯甲酸鈉最大使用量分別為0.3 g/kg、0.5 g/kg、0.3 g/kg、1.0 g/kg和1.0 g/kg?？紤]到防腐劑可能滲透到板栗果仁中，本研究使用的防腐劑濃度不超過國家規(guī)定的最大使用量，分別選擇納他霉素；納他霉素+山梨酸鉀；納他霉素和苯甲酸鈉；納他霉素+乳酸鏈球菌素；納他霉素+ε-聚賴氨酸作為單一和復(fù)合防腐劑，板栗處理后放置60 d測定腐爛率。從圖1中可以看出，對(duì)照組的板栗腐爛率為42.4%，第2～6組的腐爛率比對(duì)照組都低，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；其中第3組(納他霉素+山梨酸鉀)的腐爛率最低，板栗腐爛率為8.8%，遠(yuǎn)低于對(duì)照組，與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，防腐效果最佳。

1：對(duì)照；2：0.3 g/kg納他霉素；3：0.3 g/kg納他霉素+0.5 g/kg山梨酸鉀；4：0.3 g/kg納他霉素+0.5 g/kg苯甲酸鈉；5：0.3 g/kg納他霉素+0.2 g/kg乳酸鏈球菌素；6：0.3 g/kg納他霉素+0.2 g/kg ε-聚賴氨酸。*表示與對(duì)照差異顯著；**表示與對(duì)照差異極顯著。圖1 不同防腐劑對(duì)板栗腐爛率的影響Fig.1 Effect of different preservatives on the rot rate of chestnuts

根據(jù)圖1結(jié)果，采用0.05 g/kg、0.10 g/kg、0.20 g/kg、0.30 g/kg和0.40 g/kg的納他霉素與0.50 g/kg山梨酸鉀組成不同質(zhì)量比的復(fù)合防腐劑，優(yōu)化納他霉素的添加濃度。結(jié)果如圖2所示，隨著納他霉素濃度的提高，板栗腐爛率降低，0.2 g/kg納他霉素和0.50 g/kg山梨酸鉀組合具有較好的防腐能力，板栗的腐爛率為9%，與第一組(0.05 g/kg納他霉素+0.50 g/kg山梨酸鉀)差異顯著(P<0.05)；隨著納他霉素質(zhì)量比的增加， 0.4 g/kg納他霉素+0.50 g/kg山梨酸鉀組與第一組差異極顯著(P<0.01)，但是與0.20 g/kg納他霉素+0.50 g/kg山梨酸鉀組差異不明顯，同時(shí)，0.2 g/kg納他霉素低于食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的納他霉素使用質(zhì)量比(0.3 g/kg)。

2.2 板栗涂膜劑的篩選

涂膜劑可以降低板栗貯藏期間的呼吸強(qiáng)度，從而延長板栗的貯藏時(shí)間。根據(jù)《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760-2014)規(guī)定，普魯蘭多糖、水溶性大豆多糖等大多數(shù)涂膜劑使用量不超過10 g/kg?？紤]到選用的涂膜劑為高分子化合物，很難滲透入板栗果仁，并參考在其他農(nóng)產(chǎn)品貯藏中的應(yīng)用情況[16]，本研究中每種涂膜劑的使用質(zhì)量比為1%(即10 g/kg)，分別與篩選的防腐劑組成復(fù)合防腐劑，研究不同涂膜劑對(duì)板栗質(zhì)量損失率的影響。從圖3中可以看出，普魯蘭多糖、水溶性大豆多糖顯示出較好的保鮮效果。普魯蘭多糖涂膜保鮮效果最好，板栗的質(zhì)量損失率為7%，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；其次為水溶性大豆多糖，損失率為9%，與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，而其他3種涂膜劑效果不好。因此，選用0.2 g/kg納他霉素+0.5 g/kg山梨酸鉀+ 1%普魯蘭多糖(B組)和0.2 g/kg納他霉素+0.5 g/kg山梨酸鉀+ 1%水溶性大豆多糖 (C組)作為2種復(fù)合涂膜劑，進(jìn)行后續(xù)研究。

*表示與對(duì)照差異顯著(P<0.05)。圖3 不同涂膜劑對(duì)板栗質(zhì)量損失率的影響Fig.3 Effects of different coating compounds on mass loss weight of chestnuts

2.3 納他霉素復(fù)合涂膜劑對(duì)板栗生理生化的影響

2.3.1 復(fù)合涂膜劑對(duì)板栗腐爛率和質(zhì)量損失率的影響 板栗采用復(fù)合涂膜劑后，15 ℃貯藏90 d，測定板栗腐爛率和質(zhì)量損失率，結(jié)果見圖4，對(duì)照組(A組)的板栗因受微生物侵染，腐爛率達(dá)到64%，質(zhì)量損失率達(dá)到22%；而B組和C組對(duì)微生物均具有不同程度的防治效果，腐爛率分別為8.0%和12.0%，質(zhì)量損失率分別為5.3%和7.0%，與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，使用復(fù)合涂膜劑后可顯著提高板栗的保鮮效果。

A組：對(duì)照；B組：納他霉素(0.2 g/kg)+山梨酸鉀(0.5 g/kg)+ 1%普魯蘭多糖；C組：納他霉素(0.2 g/kg)+山梨酸鉀(0.5 g/kg)+1%水溶性大豆多糖。**表示與對(duì)照差異極顯著(P<0.01)。圖4 不同處理對(duì)板栗腐爛率和質(zhì)量損失率的影響Fig.4 Effects of different treatments on the rot rate and mass loss weight of chestnuts during storage

2.3.2 復(fù)合涂膜劑對(duì)板栗淀粉含量的影響 板栗在貯藏期間，淀粉水解為單糖供給植物呼吸而被消耗，其含量會(huì)逐漸降低，其消耗的速度與水解酶的活性以及板栗生理代謝旺盛程度有關(guān)。從圖5可看出，對(duì)照組(A組)中板栗淀粉含量在貯藏初期(30 d內(nèi))下降較快，下降了約12個(gè)百分點(diǎn)，而B組和C組下降約4個(gè)百分點(diǎn)和9個(gè)百分點(diǎn)，B組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，C組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；中期(30～45 d)比較平穩(wěn)，后期(45 d以后)快速降低。A組至第90 d時(shí)淀粉含量由初始的48.4%降低至15.4%，B組和C組下降速度明顯慢于對(duì)照組，淀粉含量分別為31.8%和27.6%，B組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，C組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，復(fù)合涂膜劑的處理對(duì)減緩板栗淀粉水解均有效果，且B組好于C組。

A組：對(duì)照；B組：納他霉素(0.2 g/kg)+山梨酸鉀(0.5 g/kg)+ 1%普魯蘭多糖；C組：納他霉素(0.2 g/kg)+山梨酸鉀(0.5 g/kg)+1%水溶性大豆多糖。圖5 板栗貯藏期間板栗淀粉含量的變化Fig.5 Changes of starch content of chestnuts during storage

2.3.3 復(fù)合涂膜劑對(duì)板栗PPO酶活性的影響 褐變是板栗在貯藏過程中質(zhì)量降低的原因之一，發(fā)生褐變的主要原因是板栗中的PPO作用于多酚類底物氧化所引起的一種病理反應(yīng)。多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐變的酶，在有氧的條件下，PPO能催化酚類物質(zhì)氧化為醌，醌通過聚合反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)導(dǎo)致組織褐變。本研究檢測了板栗保鮮過程中PPO的變化水平，由圖6可知，B組在前15 d內(nèi)上升較快，明顯高于A組和C組，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，說明普魯蘭多糖作為涂膜劑在保鮮前期抑制板栗褐變效果不佳；到第45 d時(shí)，對(duì)照A組PPO水平顯著上升，達(dá)到17.67 U/(min·g)，而B組上升幅度不大，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；45 d后，3個(gè)處理的PPO水平開始下降，B組和C組顯著下降，至90 d，PPO活性順序?yàn)椋篈>C>B，C與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，B與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。貯藏至第90 d，對(duì)照組的PPO比2個(gè)試驗(yàn)組都高約5個(gè)酶活單位，說明納他霉素復(fù)合涂膜劑有一定的防止板栗果實(shí)褐變的能力。

A組：對(duì)照；B組：納他霉素(0.2 g/kg)+山梨酸鉀(0.5 g/kg)+ 1%普魯蘭多糖；C組：納他霉素(0.2 g/kg)+山梨酸鉀(0.5 g/kg)+ 1%水溶性大豆多糖。圖6 不同處理對(duì)板栗PPO的影響Fig.6 Effects of different treatments on PPO activity of chestnut

2.3.4 復(fù)合涂膜劑對(duì)板栗POD酶活性的影響POD可清除植物組織中低濃度的H2O2，從而使植物組織免受H2O2的毒害作用。由圖7可知，隨著板栗貯藏時(shí)間的加長，對(duì)照組(A組)和處理組(B組和C組)均出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象。對(duì)照組的POD值，45 d時(shí)達(dá)到最大值[392 U/(min·g)]，原因可能是對(duì)照組的板栗被一些微生物感染，使板栗果實(shí)中的H2O2含量升高，植物組織的防御反應(yīng)會(huì)促使相應(yīng)的酶活性升高；同時(shí)，感染的微生物也會(huì)引起POD酶活性的變化，胡青平等[17]報(bào)道煙草感染青枯菌后，根、莖、葉內(nèi)的POD活性均比對(duì)照高，其中葉內(nèi)比對(duì)照增高了29.67%。而B組和C組在45 d 時(shí)POD活性為248 U/(min·g)和269 U/(min·g)，B與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，C與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。隨后A組逐漸下降，至90 d時(shí)下降到260 U/(min·g)。B組和C組的POD含量上升緩慢，75 d達(dá)到最大值，分別為320 U/(min·g)和316 U/(min·g)，POD活性順序?yàn)椋築>C>A，B組和C組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

A組：對(duì)照；B組：納他霉素(0.2 g/kg)+山梨酸鉀(0.5 g/kg)+ 1%普魯蘭多糖；C組：納他霉素(0.2 g/kg)+山梨酸鉀(0.5 g/kg)+ 1%水溶性大豆多糖。圖7 不同處理對(duì)板栗POD的影響Fig.7 Effect of different treatments on POD activity of chestnut

2.3.5 復(fù)合涂膜劑對(duì)板栗PAL酶活性的影響 植物組織在遇到不良環(huán)境時(shí)，PAL活性升高，PAL的活性可以作為植物抗逆環(huán)境的一個(gè)重要生理指標(biāo)。從圖8可以看出，在板栗保存的前15 d，3組的苯丙氨酸解氨酶活性相差不大。15 d之后各組PAL活性升高，其中A組上升比較緩慢，到60 d時(shí)達(dá)到最大值[3.8 U/(h·g)]，之后便快速下降；而B組C組板栗PAL酶活性上升較快，到90 d時(shí)，分別達(dá)到7.9 U/(h·g)和8.7 U/(h·g)，兩者相差不大，兩處理組與對(duì)照差異極顯著(P<0.01)。說明復(fù)合涂膜劑能夠提高PAL活性，從而增強(qiáng)板栗果實(shí)的抗病性，對(duì)板栗的保鮮具有積極作用。

A組：對(duì)照；B組：納他霉素(0.2 g/kg)+山梨酸鉀(0.5 g/kg)+ 1%普魯蘭多糖；C組：納他霉素(0.2 g/kg)+山梨酸鉀(0.5 g/kg)+ 1%水溶性大豆多糖。圖8 不同處理對(duì)板栗PAL的影響Fig.8 Effects of different treatments on PAL activity of chestnut

3 討 論

納他霉素主要破壞膜的通透性，從而引起菌體內(nèi)氨基酸和電解質(zhì)等物質(zhì)滲漏，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但僅限于抑制酵母和霉菌的作用，阻止絲狀真菌中黃曲霉毒素的形成，不能防治細(xì)菌的浸染[18]。普魯蘭多糖和水溶性大豆多糖具有成膜性好、無毒可食等優(yōu)良特性。因此納他霉素復(fù)合防腐劑配以普魯蘭多糖或水溶性大豆多糖成膜劑作為天然保鮮劑，對(duì)板栗的保鮮貯藏起到了良好的促進(jìn)作用，在葡萄、櫻桃等保鮮中應(yīng)用較多[6]。

本研究中采用復(fù)合防腐劑配以普魯蘭多糖或水溶性大豆多糖成膜劑處理板栗，其果實(shí)腐爛率、質(zhì)量損失率和淀粉含量等都有較大的改善，表明納他霉素復(fù)合涂膜保鮮劑主要通過抑制腐爛微生物的繁殖，防止板栗果實(shí)水分的散失，能有效抑制板栗的腐爛，從而達(dá)到良好的保鮮效果。復(fù)合防腐劑配以普魯蘭多糖或水溶性大豆多糖均能有效降低板栗果實(shí)中PPO活性；而POD活性在前期都逐漸升高，中后期對(duì)照組POD活性迅速下降，后期處理組的POD活性高于對(duì)照；處理組PAL活性始終高于對(duì)照組，尤其在儲(chǔ)存的中后期特別明顯，這說明納他霉素復(fù)合涂膜劑對(duì)減少板栗腐爛和誘導(dǎo)PAL活性的上升有一定的關(guān)系。根據(jù)板栗腐爛率、板栗淀粉含量和相關(guān)酶活性的變化，普魯蘭多糖作為板栗涂膜劑比水溶性大豆多糖效果好。納他霉素復(fù)合普魯蘭多糖涂膜劑主要通過提高板栗的抗病性，增強(qiáng)殺菌能力，避免水分蒸發(fā)，從而有效提高了板栗的保鮮效果。

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