嚴 娟， 宋志忠， 蔡志翔， 沈志軍， 馬瑞娟， 俞明亮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014)

原花青素廣泛存在于植物樹干、葉、花、果和種子中，對植物的生長發(fā)育和人體動物健康均有重要作用[1-2]。通過對擬南芥、西班牙三葉草和葡萄等幾個模式植物的研究，原花青素合成機制已經(jīng)比較明晰[3]。從苯丙烷途徑開始，通過無色花青素還原酶(Leucoanthocyanidin reductase，LAR)和花青素還原酶(Anthocyanidin reductase，ANR)2個途徑形成原花青素，因此LAR和ANR是直接調(diào)控原花青素單體以及聚合結(jié)構(gòu)單元形成的關(guān)鍵酶基因。

原花青素在果品中含量極為豐富，其生理作用顯得尤為突出[1]。一是可為果樹防御生物及非生物傷害，保證其生長發(fā)育和產(chǎn)量；二是與果實品質(zhì)和風味密切相關(guān)，賦予鮮食果品果肉以及果汁、葡萄酒等加工產(chǎn)品獨特的口感；三是原花青素還是影響果品與葡萄酒等儲藏期的關(guān)鍵因素之一；四是相較于果品中維生素和花色素苷等有益成分，其具有更高的抗氧化能力，為人類抵御各種疾病。因此，原花青素現(xiàn)已成為研究與培育富含有益成分果品的重要指標。

桃[Prunuspersica(L.) Batsch]是全球重要的薔薇科果樹，栽培廣泛，生產(chǎn)中心國包括中國、意大利、西班牙和美國等。桃種質(zhì)資源豐富，果實按肉色主要分為白肉桃、黃肉桃、紅肉桃(包括bfbf-基因型和DBF-基因型)3種類型[4]。桃果實富含抗氧化成分，與可可、葡萄酒、茶及蘋果、草莓等一樣，桃，特別是DBF-基因型紅肉桃果實中原花青素含量豐富，鮮果中總含量約為 90～700 mg/kg[5]，現(xiàn)已分離出兒茶素和表兒茶素單體以及各種低聚和高聚產(chǎn)物，對其中主要成分作了定性定量分析[6-7]。桃果實中原花青素隨發(fā)育期的積累和代謝機理的相關(guān)報道甚少，且相關(guān)研究均是以白肉桃為材料[8-10]，紅肉桃和黃肉桃相關(guān)研究尚未涉及，LAR和ANR等關(guān)鍵酶的酶學特性亦未見報道。

作者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，白、黃、紅3種肉色桃成熟果肉中的原花青素單體兒茶素和表兒茶素含量存在顯著差異[11]。因此，本研究將以瑞光19號(白肉)、浙金3號(黃肉)、紅肉大紅袍(DBF-基因型，紅肉)為材料，進行3種果肉顏色的桃原花青素積累動態(tài)的生理數(shù)據(jù)采集，測定調(diào)控原花青素合成的關(guān)鍵酶LAR和ANR的酶活力；克隆關(guān)鍵酶編碼基因(LAR、ANR)，并分析其在果實發(fā)育過程中的表達。旨在從生理、生化(酶)和轉(zhuǎn)錄水平解析不同肉色桃原花青素積累動態(tài)及其機制，為探討桃原花青素合成機理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及取樣

本研究材料瑞光19號(白肉)、浙金3號(黃肉)、紅肉大紅袍(DBF-基因型，紅肉)均取自國家果樹種質(zhì)南京桃資源圃，按照常規(guī)栽培方法種植，統(tǒng)一田間管理。每個品種從盛花后30 d開始，每隔7 d取1次樣品，每次分別取18個果，分為3組，稱量每個果實大小，快速削皮，果肉切碎混合液氮凍存。參照Lombardo等[12]的方法，根據(jù)每個品種每個發(fā)育期的果實大小平均值擬合各桃品種發(fā)育的S曲線(圖1)，確定各品種的果實發(fā)育階段和樣品點(表1)。

圖1 桃果實發(fā)育曲線圖Fig.1 The growth curve of peach fruit

表1 桃果實發(fā)育期采樣點

S1、S2、S3、S4、H分別表示果實發(fā)育天數(shù)。

1.2 原花青素的提取與測定

將適量樣品烘干至恒質(zhì)量，粉碎，過40目篩之后，稱取約0.05 g，加入1.25 ml 60%乙醇提取液，用超聲提取法進行提取，超聲功率300 W，破碎5 s，間歇8 s，提取30 min， 12 000 r/min，25 ℃，離心10 min，取上清液，用提取液定容至1.25 ml，待測。 吸取40 μl待測液和160 μl工作液(工作液試劑盒購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)，混勻，30 ℃水浴30 min，在酶標儀(Berthold TriStar LB941, 德國)上進行500 nm 單波長測定。以40 μl待測液和160 μl H2O的混合液為對照。原花青素含量單位為mg/g(干質(zhì)量，DW)，計算公式如下：

標準曲線：Y=0.019 4x+0.000 6，R2=0.999

1.3 ANR和LAR的提取和酶活力測定

取1 g果肉加入等量的PVPP，液氮研磨后加入pH7.4 的 PBS 緩沖液 4 ℃離心，上清液即為粗酶液。參考Xie等[13]和楊琴等[14]的方法，并作一定修改。200 μl 反應體系包括 0.1 mol/L的檸檬酸磷酸緩沖鹽(pH6.5)、粗酶液、反應底物[其中無色花青素還原酶的反應底物為二氫斛皮素(0.6 mol/L)，花青素還原酶的反應底物為矢車菊素(0.6 mmol/L)]、輔酶NADPH( 2 mmol/L) 和 pH7.0 的 Tris·HCl 緩沖液(0.1 mol/L)，于40 ℃下分別反應30 min， 10 倍體積乙酸乙酯終止反應，經(jīng)萃取濃縮后，甲醇定容至0.5 ml。在酶標儀(Berthold TriStar LB941, 德國)上進行280 nm單波長測定。利用原花青素標準品做標準曲線計算相對酶活力，單位為mg/g(鮮質(zhì)量，F(xiàn)W)，試驗重復3次。

1.4 果肉總RNA的提取和熒光定量PCR

果肉總RNA提取利用EASYapin Plus Plant RNA Kit試劑盒(鐘鼎，RK16-20T)，提取步驟按照試劑盒說明書進行，總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以及紫外分光光度計檢測純度合格后備用。第一鏈cDNA合成采用AMV First Strand cDNA 合成試劑盒(鐘鼎，PC01-50T)，方法參考說明書，反應條件設置：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。熒光定量RT-PCR引物和內(nèi)參基因參考 Daniela等[9]和Tong等[15]的研究。引物序列(表2)委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。熒光定量RT-PCR在ABI 7500型熒光定量PCR儀中進行，利用HiScript QRT SuperMix同引物(正反向引物各0.4 μl)和cDNA模板(2 μl)配置20 μl反應體系，設置3次重復。熒光定量RT-PCR擴增條件設置：擴增程序為94 ℃ 30 s；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s循環(huán)45 次，72 ℃單點檢測信號。溶解程序為：95 ℃ 0 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s，連續(xù)檢測信號。采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析。

表2 熒光定量PCR擴增引物

2 結(jié)果與分析

2.1 桃果實發(fā)育過程中果肉原花青素的積累變化

桃果肉原花青素含量隨果實發(fā)育的積累變化見圖2。3個桃品種原花青素含量差異很大，在發(fā)育過程中含量分布分別為 0.22～0.53 mg/g, DW、0.14～0.34 mg/g, DW 和 0.10～0.90 mg/g, DW；原花青素積累變化趨勢差異明顯。瑞光19號含量變化趨勢呈倒V形，初期較低，在S4時期急劇積累(P<0.01)，達到0.53 mg/g, DW，在成熟時又快速下降，含量為0.22 mg/g, DW。浙金3號初期含量最高，為0.34 mg/g, DW，S2到S3時期快速降低(P<0.01)，在果實發(fā)育的后期含量趨于平穩(wěn)，成熟時含量為0.15 mg/g, DW。紅肉大紅袍的原花青素含量在果實發(fā)育前期均處于很低的水平，甚至在S2時期明顯下降，但隨著果實發(fā)育，其含量急劇增加，成熟時達到最高，高達0.90 mg/g, DW。在S1時期，原花青素含量表現(xiàn)為浙金3號>瑞光19號>紅肉大紅袍，其中浙金3號是紅肉大紅袍的2倍(P<0.01)；到了H時期，原花青素含量則為紅肉大紅袍>瑞光19號>浙金3號，紅肉大紅袍是瑞光19號和浙金3號的5倍(P<0.01)。

2.2 桃果實發(fā)育過程中LAR和ANR的酶活力

LAR和ANR隨桃果實發(fā)育的酶活力變化見圖3。同一桃品種中LAR和ANR的酶活力大小有差異，但變化趨勢基本一致；而3個桃品種之間LAR和ANR酶活力變化趨勢差異明顯，在發(fā)育不同時期活力差異大。

瑞光19號LAR和ANR的酶活力變化趨勢較一致，均是在S1至S3時期升高(P<0.05)，在S4時期急劇升高(P<0.01)，然后急劇下降(P<0.01)；但LAR的酶活力(0.28～0.74 mg/g, FW)在各個發(fā)育階段均略高于ANR(0.11～0.61 mg/g, FW)。浙金3號LAR和ANR的酶活力(0.20～0.43 mg/g, FW 和 0.15～0.46 mg/g, FW)和變化趨勢均基本相同，表現(xiàn)為隨著果實發(fā)育逐漸降低，H時期達到最低(P<0.01)。紅肉大紅袍LAR和ANR的酶活力分別為 0.17～0.36 mg/g, FW和 0.12～0.80 mg/g, FW，除了S1和S2時期LAR酶活力略高于ANR外，其他時期，特別是果實成熟期，ANR酶活力遠遠大于LAR；2個酶的酶活力變化趨勢也有輕微差異，LAR酶活力在S1至S3時期沒有顯著差異，在S4和H時期則顯著升高(0.01

S1、S2、S3、S4、H見表1。圖2 桃果肉中原花青素含量變化Fig.2 The changes of proanthocyanidin content in flesh of peach

S1、S2、S3、S4、H見表1。圖3 桃果實發(fā)育過程中LAR和ANR酶活力Fig.3 The activities of LAR and ANR during fruit development period

在S1時期，LAR的活性表現(xiàn)為浙金3號>瑞光19號>紅肉大紅袍，其中浙金3號是紅肉大紅袍的2.0倍；到了H時期，LAR的活力則為瑞光19號>紅肉大紅袍>浙金3號。ANR的活力和LAR相似，即在S1時期，ANR的活力為浙金3號>瑞光19號>紅肉大紅袍，浙金3號的ANR酶活力是瑞光19號和紅肉大紅袍的5.0倍；到了H時期，ANR的活力則為紅肉大紅袍>瑞光19號>浙金3號，紅肉大紅袍是瑞光19號的2.5倍、浙金3號的7.0倍。

2.3 桃果實發(fā)育過程中LAR和ANR的基因表達

定量PCR結(jié)果見圖4。結(jié)果表明同一桃品種中LAR和ANR基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達量有差異，但變化趨勢基本一致。瑞光19號LAR和ANR表達量均是在S4時期達到最高(P<0.05)，然后在H時期急劇下降(P<0.01)。浙金3號LAR基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達量在S1時期最高，并在S2時間急劇降低(P<0.01)，之后，隨著果實發(fā)育變化不顯著；然而，ANR基因在S1至S4各時期的表達量沒有顯著差異，但顯著高于H時期(P<0.05)。紅肉大紅袍LAR和ANR表達量變化趨勢有輕微差異，LAR基因在S1至S3時期的表達水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)，但從S4時期開始至H時期則顯著升高(P<0.01)；ANR基因的表達水平則隨著果實不同發(fā)育時期而顯著升高，在S4時期達到最高水平(P<0.01)。

3個桃品種之間LAR和ANR表達量變化趨勢差異明顯，在發(fā)育不同時期表達量差異大。在S1時期，LAR基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達量由高到低依次為浙金3號>紅肉大紅袍>瑞光19號，其中浙金3號LAR的表達量是紅肉大紅袍和瑞光19號的2倍(P<0.01)；而在H期，LAR的表達量由高到低依次為 紅肉大紅袍>瑞光19號>浙金3號。然而，ANR的表達量在S1時期表現(xiàn)為浙金3號> 瑞光19號>紅肉大紅袍，但到H時期，則恰好相反，表現(xiàn)為 紅肉大紅袍>瑞光19號>浙金3號，其中紅肉大紅袍的ANR表達量約為瑞光19號和浙金3號的10倍(P<0.01)。

S1、S2、S3、S4、H見表1。圖4 桃果實發(fā)育過程中LAR和ANR基因表達Fig.4 Relative expression of LAR and ANR during fruit development period

3 討 論

原花青素的相關(guān)研究在其他果品中已非常深入和廣泛，如葡萄[16]、柿子[17]、蘋果[18]、草莓[19]、杏[20]、黑莓[21]等，相關(guān)報道涉及原花青素在果實中的組成和隨發(fā)育期的含量變化，各種栽培措施、激素和貯藏條件對其組分的影響，生物合成關(guān)鍵酶LAR和ANR的酶學特性和基因表達、以及功能驗證等。相較而言，桃果實中原花青素隨發(fā)育期的積累以及代謝機理研究報道鮮少，特別是關(guān)于紅肉或黃肉桃果實中原花青素的積累尚未報道。

在前人研究中，白肉桃晚蜜隨著果實成熟，原花青素總量逐漸降低[8]；白肉桃Stark Red Gold和Baifeng的原花青素總量隨著果實發(fā)育先積累，隨后又逐漸下降[9-10]。本研究以3種肉色桃果實為試驗材料，發(fā)現(xiàn)原花青素在不同肉色桃的果實發(fā)育過程中積累趨勢完全不同。在白肉桃中表現(xiàn)為先升高后降低，在黃肉桃中表現(xiàn)為逐漸下降，說明在所試驗的白肉桃和黃肉桃中原花青素的積累都伴隨著果實成熟而降低，這與前人研究結(jié)果一致[8-10]，也與葡萄、草莓和黑莓等其他果品研究結(jié)果相似[21-22]。而DBF-基因型紅肉桃則恰好相反，隨果實發(fā)育急劇增加，在成熟時達到最高，且遠遠高于白肉桃和紅肉桃。這一結(jié)果在前期研究中也有所體現(xiàn)，即白肉桃和黃肉桃成熟果肉中原花青素單體兒茶素和表兒茶素的含量均遠遠低于紅肉桃中兒茶素和表兒茶素的含量[11]。在桃育種實踐工作中，紅肉桃果實在口感上普遍存在澀味，這可能與其成熟時含有大量原花青素有關(guān)。針對紅肉桃中原花青素有別于在白肉桃、黃肉桃以及其他果品中的積累規(guī)律，其相關(guān)機制需要進行進一步深入研究和探討。

LAR和ANR基因是直接調(diào)控果品原花青素單體以及聚合結(jié)構(gòu)單元形成的關(guān)鍵酶基因[23-24]。具體地，LAR途徑合成2,3-反式黃烷-3-醇，如兒茶素，ANR途徑生成2,3-順式黃烷-3-醇，如表兒茶素。Daniela 等[9]提出CHS、CHI、FSH、DFR、LDOX、UFGT、ANR、LAR、FLS1結(jié)構(gòu)基因的表達與原花青素合成有關(guān)，調(diào)控因子PA1對ANR和LAR的表達具有調(diào)控作用；而 Zhou等[10]的研究則著重提出調(diào)控因子MYB7調(diào)控LAR基因的表達，而非ANR。本研究則以3種肉色桃為材料，探討了原花青素積累與關(guān)鍵酶LAR、ANR的酶活力和酶基因表達量的關(guān)系。結(jié)果表明，在同一材料中，LAR、ANR的酶活力及其編碼基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況與原花青素積累趨勢一致。本研究結(jié)果很好地證實LAR和ANR是桃果實中原花青素合成的關(guān)鍵調(diào)控基因。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在白肉桃和黃肉桃中，LAR的酶活力和基因表達量與原花青素的積累相關(guān)性更為密切，而在紅肉桃中，ANR與原花青素的積累更為密切，這一結(jié)果可部分解釋嚴娟等[11]報道的兒茶素含量在白肉桃和黃肉桃高，而表兒茶素在紅肉桃中高。本研究結(jié)果初步明確了不同果肉顏色的桃原花青素積累與LAR、ANR酶活力及其編碼基因之間的內(nèi)在聯(lián)系，為進一步探討桃原花青素合成機理提供了基礎(chǔ)。

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