張麗麗， 徐碧玉， 劉菊華， 賈彩紅， 張建斌， 金志強(qiáng),2

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實驗室,海南 ?？?571101； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯嶒炚?海南省香蕉遺傳育種改良重點(diǎn)實驗室,海南 海口 570102)

環(huán)境的非生物脅迫，如干旱，極端溫度，寒冷，重金屬，或高鹽，嚴(yán)重?fù)p害植物生長和生產(chǎn)力。干旱是最嚴(yán)重的環(huán)境脅迫，超過任何其他環(huán)境因素，嚴(yán)重?fù)p害植物的生長和發(fā)育，限制植物生產(chǎn)和作物的性能[1]。植物激素，如脫落酸(ABA)、乙烯(ET)、水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)對植物的生長和發(fā)育有廣泛的影響，它們調(diào)節(jié)植物抵御生物和非生物脅迫的保護(hù)性應(yīng)答[2-6]。不同的非生物脅迫和生物脅迫，經(jīng)常通過共享或重疊激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來引發(fā)植物響應(yīng)[7-8]。

乙烯在試驗中被證明可以關(guān)閉氣孔[9]，環(huán)境誘導(dǎo)乙烯積累可以導(dǎo)致氣孔關(guān)閉也已經(jīng)被報道[10]。乙烯應(yīng)答因子ERF類蛋白在植物生長發(fā)育尤其是在植物應(yīng)對非生物脅迫中起著非常重要的作用[11-12]。在早期的研究中發(fā)現(xiàn)來自番茄的乙烯應(yīng)答因子蛋白JERF3 通過調(diào)節(jié)氧化脅迫應(yīng)答來增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對干旱、鹽和冷害的耐受力[13]。JERF1和JERF3基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的過量表達(dá)會引起一系列生理和分子的變化，從而增強(qiáng)水稻對干旱和氧化脅迫的耐受力[14]。植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)依賴于參與脅迫感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、及特定脅迫和代謝相關(guān)基因表達(dá)的分子網(wǎng)絡(luò)的激活[15]。研究結(jié)果表明番茄SlERF5在擬南芥對生物和非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[16]。SlERF5基因在番茄中的過量表達(dá)會增強(qiáng)番茄對干旱和高鹽脅迫的耐受力[17]。油菜乙烯應(yīng)答因子BrERF4在擬南芥中的過量表達(dá)可以增強(qiáng)擬南芥對干旱和鹽的耐受力[18]。擬南芥ERF022可以通過乙烯途徑調(diào)節(jié)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)[19]，擬南芥ERF1通過結(jié)合不同的順式作用元件來調(diào)節(jié)非生物脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)[20]。OsEF109可以顯著提高水稻對干旱脅迫的耐受性[21],OsERF3的過表達(dá)改變了對乙烯生物合成的調(diào)控，揭示了乙烯對植株耐旱性的正調(diào)節(jié)作用[22]。

此外有一些ERF類蛋白在植物響應(yīng)脅迫時發(fā)揮負(fù)調(diào)控的作用，比如擬南芥AtERF4和AtERF7作為轉(zhuǎn)錄抑制因子來調(diào)控ABA的應(yīng)答[23-24]。AtERF7在擬南芥中的過量表達(dá)可以使保衛(wèi)細(xì)胞降低對ABA的敏感性，因此通過氣孔增加了水分的損失，AtERF7在擬南芥中的過量表達(dá)甚至抑制被ABA誘導(dǎo)的基因的表達(dá)從而降低了對干旱脅迫的耐受力[23]。AtERF4與AtERF7發(fā)揮調(diào)控作用的原理相似，它可以增強(qiáng)植物對鹽脅迫的敏感性[24]。

MaASR1是從香蕉果實的cDNA文庫中獲得的一個ASR基因，本實驗室前期的研究結(jié)果表明香蕉植株在干旱脅迫條件下，MaASR1基因在根部和葉片中的表達(dá)量大幅上升，這說明MaASR1基因主要參與植物在面臨干旱脅迫時的應(yīng)答反應(yīng)[25]。為了深入研究MaASR1基因在香蕉干旱脅迫中發(fā)揮作用的抗性機(jī)制，將MaASR1基因轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)基因純合株系L14[25]。L14在干旱脅迫條件下的存活率優(yōu)于野生型擬南芥植株[25]。并且在轉(zhuǎn)基因株系中，MaASR1基因的表達(dá)量越大，則該株系表現(xiàn)出來的抗旱能力則越強(qiáng)[25-26]。這些證據(jù)都能說明MaASR1基因的轉(zhuǎn)入能夠提高擬南芥的抗旱性[25]。為了進(jìn)一步研究MaASR1基因轉(zhuǎn)入擬南芥后增強(qiáng)其抗旱性的分子機(jī)制，運(yùn)用DNA芯片技術(shù)來篩選野生型擬南芥和轉(zhuǎn)MaASR1基因擬南芥在不做任何處理和干旱脅迫處理條件下的差異基因，希望能進(jìn)一步解析香蕉MaASR1基因通過乙烯途徑提高擬南芥抗旱性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana. Columbia ecotype)是從美國俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心購買的。轉(zhuǎn)MaASR1基因的轉(zhuǎn)基因型擬南芥命名為L14，是由本實驗室構(gòu)建植物表達(dá)載體后通過農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)化得到的。

1.2 所用引物

本研究所用引物見表1。

1.3 試驗方法

1.3.1 對野生型和MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的干旱處理 在MS固體培養(yǎng)基上播種野生型擬南芥WT和MaASR1轉(zhuǎn)基因株系L14的種子，4 ℃條件下處理3 d (該步驟主要是對種子進(jìn)行春化處理)，然后在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。溫度為 21～23 ℃，每日光照和黑暗培養(yǎng)時間分別為8 h和16 h。光照度為2 000 lx，相對濕度為70%。15 d后，選擇生長出 2～4片葉片的幼苗，將其從培養(yǎng)皿中取出，置于蓋有2個培養(yǎng)皿的濾紙之上，然后在光照培養(yǎng)箱中模擬干旱脅迫條件進(jìn)行處理。處理時間分別為0 h、2 h和6 h，然后分別取樣0.2 g，擬南芥的取樣部位為整個擬南芥幼苗植株，在液氮中冷凍之后于-70 ℃保存[25]。

表1 本研究所用引物

1.3.2 野生型和MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片總RNA的提取及cDNA的合成 取干旱處理0 h、2 h和6 h的試驗材料，用QIAGEN plant RNA Kit試劑盒來提取擬南芥的總RNA。然后用Fermentas的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第1條鏈。熒光定量PCR的引物序列見表1，qRT-PCR儀器型號為Mx3000P(Stratagene，USA)，以擬南芥看家基因AtActin(基因登錄號AK318637)為內(nèi)參基因。熒光定量PCR程序為94 ℃，30 s；94 ℃ 7 s，55 ℃(57 ℃) 15 s，72 ℃ 20 s,40個循環(huán)。

1.3.3 熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010軟件完成，利用DPS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,差異顯著性檢驗和相關(guān)性分析。

1.3.4 表達(dá)譜芯片的制作和分析 提取MaASR1轉(zhuǎn)基因株系(編號為L14)和野生型擬南芥的總RNA，委托博奧生物有限公司制作2種類型的表達(dá)譜芯片，一種是轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥在自然狀態(tài)即未作任何脅迫處理條件下的DNA芯片，命名為14 vs WT，其中14代表非脅迫處理下轉(zhuǎn)基因株系L14，WT代表非脅迫處理下野生型擬南芥；另一種是干旱處理2 h的MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥L14與野生型表達(dá)譜芯片，命名為Y vs W，其中Y代表干旱脅迫處理下轉(zhuǎn)基因株系L14，W代表干旱脅迫處理下野生型擬南芥。2種類型的芯片各重復(fù)3次以減少誤差。并對所得到的DNA芯片的結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析和差異基因的篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)譜芯片差異基因的通路分析

表達(dá)譜芯片的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：Ratio≥2代表表達(dá)上調(diào)大于2倍的基因，Ratio≤0.5代表表達(dá)下調(diào)大于2倍的基因。14 vs WT一共得到747個差異基因，其中上調(diào)基因559個，下調(diào)基因188個；Y vs W一共得到653個差異基因，其中上調(diào)基因256個，下調(diào)基因397個[27]。

在14 vs WT芯片中得到的差異基因經(jīng)分析共找到61個相關(guān)的pathway，主要涉及淀粉和蔗糖的代謝，磷酸戊糖途徑，糖酵解及糖異生，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑。共有9個差異基因參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(表2)，其中8個差異基因上調(diào)，1個差異基因下調(diào)。

在Y vs W芯片中得到的差異基因經(jīng)分析共找到58個相關(guān)的pathway，主要涉及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，光合作用，葉綠素代謝，植物生長節(jié)律等代謝途徑。共有20個差異基因參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(表3)，其中5個差異基因上調(diào)，15個差異基因下調(diào)。

表2 14 vs WT芯片中差異基因的通路分析

表3 Y vs W芯片中差異基因的通路分析

通過對表達(dá)譜芯片進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)分析(主要包括Network分析，Gene ontology分析以及Pathway分析)，發(fā)現(xiàn)MaASR1基因提高植物抗旱性與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有密切的關(guān)系。本研究重點(diǎn)研究了與乙烯途徑的關(guān)系，經(jīng)分析得到了與乙烯途徑相關(guān)的幾個關(guān)鍵基因，分別是：ACO1(ACC OXIDASE 1)，即ACC氧化酶基因；ACS6(1-AMINOCYCLOPROPANE-1- CARBOXYLIC ACID (ACC) SYNTHASE 6)，即ACC合成酶基因；AtERF4(ETHYLENE RESPONSIVE ELEMENT BINDING FACTOR)，即乙烯應(yīng)答元件結(jié)合因子基因；AtERF5、AtERF6、AtERF8、AtERF11、AtERF13、AtETR2(ETHYLENE RESPONSE 2)，即乙烯受體基因；AtERS2(ETHYLENE RESPONSE SENSOR 2)，即乙烯反應(yīng)傳感蛋白基因；AtEBF2(EIN3-BINDING F BOX PROTEIN 2)，即結(jié)合AtEIN3的F-box蛋白基因；At5g61600(ethylene-responsive element-binding family protein)，即乙烯響應(yīng)結(jié)合元件家族蛋白基因[27]。

2.2 表達(dá)譜芯片中野生型及MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥乙烯應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)

ACS6與ACO1參與乙烯生物合成過程，AtERF4、AtERF5、AtERF6、AtERF8、AtERF11、AtERF13乙烯應(yīng)答元件結(jié)合因子，從AtERF4～AtERF11都參與乙烯介導(dǎo)的信號途徑。利用Real-time RT-PCR檢測野生型及MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥不同時間的干旱處理及在不做任何脅迫處理條件下乙烯相關(guān)基因的表達(dá)變化，來進(jìn)行芯片結(jié)果的驗證。

如圖1所示，參與乙烯生物合成途徑的AtACS6和AtACO1，MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥在未受干旱脅迫和干旱脅迫2 h時的基因表達(dá)量均高于野生型，而在干旱脅迫6 h時野生型擬南芥基因的表達(dá)量則明顯高于MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥。

參與乙烯信號途徑的ERF類基因，AtERF6、AtERF11和AtERF13基因變化趨勢相同，MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥在未受干旱脅迫和干旱脅迫2 h、6 h時的基因表達(dá)量均高于野生型；AtERF5和AtERF8基因變化趨勢相同，在未受干旱脅迫時MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因表達(dá)量明顯高于野生型，在干旱脅迫2 h時MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型基因表達(dá)量基本相同，而在干旱脅迫6 h時野生型擬南芥基因表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)基因擬南芥；AtERF4基因變化趨勢與前兩類均不同，在未受干旱脅迫處理時，轉(zhuǎn)基因擬南芥基因表達(dá)量與野生型差異不顯著，而在干旱脅迫2 h和6 h時，轉(zhuǎn)基因擬南芥基因表達(dá)量則明顯高于野生型。

乙烯受體基因AtETR2和AtERS2在未受干旱脅迫和干旱脅迫2 h和6 h時，MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥基因表達(dá)量都高于野生型。

未受干旱脅迫時AtEBF2在MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥中的基因表達(dá)量明顯高于野生型。干旱脅迫2 h和6 h時的基因表達(dá)量在MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型中沒有顯著差異。

未受干旱脅迫和干旱脅迫2 h時，乙烯響應(yīng)結(jié)合元件家族蛋白At5g61600在MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量均高于野生型，在干旱脅迫6 h時MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥表達(dá)量低于野生型，達(dá)到了極顯著差異。

從表4中芯片檢測數(shù)據(jù)與Realtime-PCR數(shù)據(jù)之間相關(guān)性分析可以看出，相關(guān)系數(shù)均大于0.7，這說明芯片檢測數(shù)據(jù)與Realtime-PCR數(shù)據(jù)是極顯著正相關(guān)的關(guān)系，說明得到的芯片數(shù)據(jù)是可靠的。

3 討 論

AtACS6即ACC合成酶，是整個乙烯合成途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，SAM在ACC合酶(ACC synthase,ACS)的催化下產(chǎn)生氨基環(huán)丙烷羧酸(1-aminocyclo- propane-1-carboxylic acid, ACC)，ACC在AtACO1即ACC氧化酶的催化下產(chǎn)生乙烯。RT-PCR結(jié)果表明，在干旱脅迫2 h時，AtACS6和AtACO1在MaASR1轉(zhuǎn)基因株系的表達(dá)水平與野生型相比明顯提高。這表明在干旱脅迫條件下，MaASR1的轉(zhuǎn)入提高了擬南芥體內(nèi)的乙烯合成水平。

在植物的乙烯反應(yīng)途徑中，第一步是乙烯與受體分子相結(jié)合。在擬南芥中共有5個乙烯受體，它們表現(xiàn)出功能冗余。多種乙烯受體的存在是乙烯反應(yīng)順利進(jìn)行所必需的，即使其中的一個受體功能喪失了或者發(fā)生了突變，乙烯反應(yīng)也不受影響。乙烯受體對乙烯反應(yīng)起負(fù)調(diào)控作用，擬南芥中乙烯反應(yīng)的誘導(dǎo)是由于這些蛋白質(zhì)的失活而不是激活[28]。受體本身處于開啟狀態(tài)，抑制乙烯反應(yīng)，乙烯與受體的結(jié)合使受體關(guān)閉[29]。乙烯缺乏時，乙烯受體與CTRI結(jié)合，形成ETR-CTRI復(fù)合體，激活CTRI的負(fù)調(diào)控活性, 不產(chǎn)生乙烯反應(yīng)；乙烯存在時，乙烯與受體結(jié)合，CTRI不能被激活，產(chǎn)生乙烯反應(yīng)。乙烯受體和CTRI都是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控器，乙烯與受體結(jié)合鈍化其負(fù)調(diào)控活性[30]。位于乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游和末端的EIN2、EIN3和ERF1都是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控器[31]。EBF2即結(jié)合EIN3的F-box蛋白，EBF1/ EBF2通過一條泛蛋白/蛋白酶體途徑作用于EIN3蛋白，使EIN3蛋白迅速降解。說明EBF1/ EBF2間接對乙烯反應(yīng)起負(fù)調(diào)控作用[32]。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)。圖1 野生型及MaASR1轉(zhuǎn)基因擬南芥乙烯應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)的Realtime-PCR驗證Fig.1 The expression profile of ethylene related genes detected by Realtime-PCR in wild-type and the MaASR1 transgenic line L14

表4 芯片數(shù)據(jù)與熒光定量PCR結(jié)果的相關(guān)性

ERFs 類的轉(zhuǎn)錄因子在植物對非生物脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。ERF轉(zhuǎn)錄因子可以與順式作用元件DRE/CRT結(jié)合，而DRE/CRT廣泛存在于與植物對干旱、冷害和鹽害等非生物脅迫等密切相關(guān)的功能基因的啟動子中。ERF轉(zhuǎn)錄因子可以通過識別順式作用元件DRE/CRT調(diào)節(jié)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。水稻中ERFs轉(zhuǎn)錄因子TSRF1的過量表達(dá)可以提高水稻的抗旱性[33]；在水稻中克隆和鑒定了4個ERF類轉(zhuǎn)錄因子OsBIERF1～OsBIERF4，它們都參與植物對非生物脅迫的應(yīng)答[34]。可溶性糖和脯氨酸是參與植物滲透調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素，它們可以增強(qiáng)植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力[35-36]。JERF3基因在水稻中的過量表達(dá)能提高在干旱脅迫下可溶性糖和脯氨酸的積累水平從而抵御干旱[37]。

以上研究結(jié)果都表明，ERFs 轉(zhuǎn)錄因子在植物的非生物脅迫應(yīng)答中具有非常重要的作用。從表達(dá)譜芯片的分析結(jié)果和RT-PCR的結(jié)果顯示，在2 h干旱脅迫條件下AtERF4、AtERF6、AtERF8、AtERF11、AtERF13的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中比野生型有明顯的提高，其中AtERF8的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中與野生型相比差異顯著，AtERF4、AtERF6、AtERF11、AtERF13的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中與野生型相比差異極顯著。在2 h干旱脅迫條件下，AtERF5的表達(dá)在野生型和轉(zhuǎn)基因型中沒有明顯變化；但在未進(jìn)行干旱脅迫時AtERF5的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中比野生型有明顯的提高，差異極顯著。以上結(jié)果表明MaASR1可以通過提高AtERF類基因的表達(dá)來賦予擬南芥植物抗旱性。在干旱脅迫條件下AtETR2和AtERS2的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中比野生型有所提高，由于乙烯受體有功能冗余，所以乙烯受體AtETR2和AtERS2表達(dá)量的變化不會影響最后的乙烯反應(yīng)。在干旱脅迫2 h時，乙烯負(fù)調(diào)控因子AtEBF2的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中與野生型沒有明顯差異，在干旱脅迫6 h時，AtEBF2的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中比野生型明顯下降，因此是有利于乙烯反應(yīng)的進(jìn)行。在干旱脅迫2 h時，乙烯應(yīng)答蛋白基因At5g61600在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量比野生型顯著提高。

目前尚沒有AtASR基因通過調(diào)節(jié)乙烯途徑來提高植物抗旱性的報道，以上芯片生物信息學(xué)分析以及RT-PCR的研究結(jié)果表明，MaASR1基因可以通過正調(diào)控乙烯反應(yīng)和提高AtERF類基因的表達(dá)來賦予植物抗旱性。并且在干旱脅迫條件下，MaASR1的轉(zhuǎn)入通過提高AtACS6和AtACO1的表達(dá)水平提高了擬南芥體內(nèi)的乙烯合成水平，這為深入解析MaASR1基因提高植物抗旱性的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1] SHAO H B, CHU L Y, JALEEL C A, et al. Understanding water deficit stress-induced changes in the basic metabolism of higher plants-biotechnologically and sustainably improving agriculture and the ecoenvironment in arid regions of the globe[J]. Crit Rev Biotechnol, 2009, 29(2)：131-151.

[2] FUJITA M, FUJITA Y, NOUTOSHI Y, et al. Crosstalk between abiotic and biotic stress responses：a current view from the points of convergence in the stress signaling networks[J]. Curr Opin Plant Biol, 2006, 9(4)：436-442.

[3] VERMA V, RAVINDRAN P, KUMAR P P. Plant hormone-mediated regulation of stress responses[J]. BMC Plant Biol, 2016, 16：86.

[4] NGUYEN D, RIEU I, MARIANI C, et al. How plants handle multiple stresses：hormonal interactions underlying responses to abiotic stress and insect herbivory[J]. Plant Mol Biol, 2016, 91(6)：727-740.

[5] 張 帆，李景富，姜景彬，等．外源水楊酸誘導(dǎo)對番茄幼苗抗冷性的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017,45(3):91-94.

[6] 孫驗玲，徐遠(yuǎn)超，李 帥，等. 玉米耐受鹽脅迫的調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016,48(11):157-163.

[7] MITTLER R, BLUMWALD E. Genetic engineering for modern agriculture：challenges and perspectives[J]. Annual Review of Plant Biology, 2010, 61：443-462.

[8] LEE S C, LUAN S. ABA signal transduction at the crossroad of biotic and abiotic stress responses[J]. Plant Cell Environ, 2012, 35(1)：53-60.

[9] DESIKAN R, LAST K, HARRETT-WILLIAMS R, et al. Ethylene-induced stomatal closure in Arabidopsis occurs via AtrbohF-mediated hydrogen peroxide synthesis[J]. Plant J, 2006, 47(6)：907-916.

[10] VYSOTSKAYA L, WILKINSON S, DAVIES W J, et al. The effect of competition from neighbours on stomatal conductance in lettuce and tomato plants[J]. Plant Cell Environ, 2011, 34(5)：729-737.

[11] JOO J, CHOI H J, LEE Y H, et al. A transcriptional repressor of theERFfamily confers drought tolerance to rice and regulates genes preferentially located on chromosome 11[J]. Planta, 2013, 238：155-170.

[12] REN M Y, FENG R J, SHI H R, et al. Expression patterns of members of the ethylene signaling-related gene families in response todehydration stresses in cassava[J]. PLoS One, 2017, 12(5)：e0177621.

[13] WU L J, ZHANG Z J, ZHANG H W, et al. Transcriptional modulation of ethylene response factor protein jerf3 in the oxidative stress response enhances tolerance of tobacco seedlings to salt, drought, and freezing[J]. Plant Physiol, 2008, 148(4)：1953-1963.

[14] ZHANG H W, LIU W, WAN L Y, et al. Functional analyses of ethylene response factor JERF3 with the aim of improving tolerance to drought and osmotic stress in transgenic rice[J]. Transgenic Res, 2010, 19(5)：809-818.

[15] VINOCUR B, ALTMAN A. Recent advances in engineering plant tolerance to abiotic stress：achievements and limitations[J]. Curr Opin Biotech, 2005, 16(2)：123-132.

[16] CHUANG H W, HARNRAK A, CHEN Y C, et al. A harpin-induced ethylene-responsive factor regulates plant growth and responses to biotic and abiotic stresses[J]. Biochem Bioph Res Co, 2010, 402(2)：414-420.

[17] PAN Y, SEYMOUR G B, LU C G, et al. An ethylene response factor (ERF5) promoting adaptation to drought and salt tolerance in tomato[J]. Plant Cell Rep, 2012, 31(2)：349-360.

[18] SEO Y J, PARK J B, CHO Y J, et al. Overexpression of the ethylene-responsive factor gene brerf4 from brassica rapa increases tolerance to salt and drought in arabidopsis plants[J]. Mol Cells, 2010, 30(3)：271-277.

[19] NOWAK K, WOJCIKOWSKA B, GAJ M D. ERF022 impacts the induction of somatic embryogenesis in Arabidopsis through the ethylene related pathway[J]. Planta, 2015, 241：967-985.

[20] CHENG M C, LIAO P M, KUO W W, et al. The Arabidopsis ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulatesabiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals[J]. Plant Physiol, 2013, 162(3)：1566-1582.

[21] YU Y, YANG D, ZHOU S, et al. The ethylene response factor OsERF109 negatively affects ethylene biosynthesis and droughttolerance in rice[J]. Protoplasma, 2017, 254(1)：401-408

[22] ZHANG H, ZHANG J, QUAN R, et al. EAR motif mutation of rice OsERF3 alters the regulation of ethylene biosynthesis and drought tolerance[J]. Planta, 2013, 237：1443-1451.

[23] SONG C P, AGARWAL M, OHTA M, et al. Role of anArabidopsisAP2/EREBP-type transcriptional repressor in abscisic acid and drought stress responses[J]. Plant Cell, 2005, 17(8)：2384-2396.

[24] YANG Z, TIAN L N, LATOSZEK-GREEN M, et al. ArabidopsisERF4 is a transcriptional repressor capable of modulating ethylene and abscisic acid responses[J]. Plant Mol Biol, 2005, 58(4)：585-596.

[25] 王 園.香蕉ASR基因抗逆功能的研究[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué), 2010.

[26] 苗紅霞, 王 園, 徐碧玉, 等. 香蕉MaASR1基因的抗干旱作用[J]. 植物學(xué)報, 2014, 49 (5)：548-559.

[27] 張麗麗，香蕉轉(zhuǎn)錄因子基因-MaASR1提高擬南芥抗旱能力的調(diào)控機(jī)理研究[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué), 2012.

[28] HUA J, MEYEROWITZ E M. Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family inArabidopsisthaliana[J]. Cell, 1998, 94(2)：261-271.

[29] 王中鳳, 應(yīng)鐵進(jìn). 植物乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進(jìn)展[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報, 2004, 30(6)：601-608.

[30] BLEECKER A B, KENDE H. Ethylene：A gaseous signal molecule in plants[J]. Annu Rev Cell Dev Bi, 2000, 16：1-18.

[31] KLEE H J. Ethylene signal transduction. moving beyond Arabidopsis[J]. Plant Physiol, 2004, 135(2)：660-667.

[32] GUO H W, ECKER J R. Plant responses to ethylene gas are mediated by SCF (EBF1/EBF2)-dependent proteolysis of EIN3 transcription factor[J]. Cell, 2003, 115(6)：667-677.

[33] QUAN R D, HU S J, ZHANG Z L, et al. Overexpression of an ERF transcription factor TSRF1 improves rice drought tolerance[J]. Plant Biotechnol J, 2010, 8(4)：476-488.

[34] CAO Y F, SONG F M, GOODMAN R M, et al. Molecular characterization of four rice genes encoding ethylene-responsive transcriptional factors and their expressions in response to biotic and abiotic stress[J]. J Plant Physiol, 2006, 163(11)：1167-1178.

[35] ZHAO F Y, WANG Z L, ZHANG Q, et al. Analysis of the physiological mechanism of salt-tolerant transgenic rice carrying a vacuolar Na+/H+antiporter gene from Suaeda salsa[J]. J Plant Res, 2006, 119(2)：95-104.

[36] VERBRUGGEN N, HERMANS C. Proline accumulation in plants：a review[J]. Amino Acids, 2008, 35(4)：753-759.

[37] ZHANG H W, LIU W, WAN L Y, et al. Functional analyses of ethylene response factor JERF3 with the aim of improving tolerance to drought and osmotic stress in transgenic rice[J]. Transgenic Res, 2010, 19(5)：809-818.