萬敏娜 金鐘奎 湯 澄

(宜春市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，宜春 336000)

糖尿病心肌病是一種慢性疾病，是獨立于糖尿病以外的并發(fā)癥，主要以心肌纖維化、膠原纖維沉積為主要特征，心肌纖維化的主要原因是成纖維細(xì)胞過度增殖，細(xì)胞外基質(zhì)大量合成，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出降解的速度[1,2]。第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)是一種與細(xì)胞生長和凋亡等有關(guān)的基因，在惡性腫瘤、肺組織纖維化等疾病中具有調(diào)控作用，基因敲除PTEN后小鼠心臟和體重之間比例增加，心肌纖維化程度加重，心肌收縮能力降低[3,4]。心肌成纖維細(xì)胞表達(dá)PTEN，在醛固酮等致病因子的作用下其表達(dá)水平下調(diào)，PTEN在糖尿病心肌病大鼠模型的心肌組織中表達(dá)水平低于正常大鼠[5,6]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)廣泛存在于哺乳動物組織器官中，在細(xì)胞生長、疾病發(fā)生中具有關(guān)鍵作用，STAT3磷酸化水平升高后，可以促進(jìn)細(xì)胞生長，抑制STAT3信號通路后的心肌成纖維細(xì)胞增殖能力[7,8]。本研究旨在探討PTEN對高糖誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響，以期為研究糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 24 h內(nèi)出生的乳鼠由江西中醫(yī)藥大學(xué)提供；PTEN過表達(dá)載體(pSicoR-PTEN)由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗室構(gòu)建保存；PTEN、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物由上海生工合成；STAT3通路阻斷劑AG490為美國MCE產(chǎn)品；RNA提取試劑盒、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒為德國QIAGEN產(chǎn)品；Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶為美國Sigma產(chǎn)品；STAT3一抗、磷酸化的STAT3(p-STAT3)一抗、GAPDH一抗為美國Santa Cruz產(chǎn)品；DAB顯色試劑盒為北京Solarbio產(chǎn)品；cDNA合成試劑盒為大連TaKaRa產(chǎn)品；qRT-PCR試劑盒為美國Roche產(chǎn)品；Lipofectamine2000為美國Thermo產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1心肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng) 心肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[9]，將24 h內(nèi)出生的乳鼠用酒精消毒后，取心臟，放在4℃的磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffered saline，PBS)中洗滌后，加入75%的乙醇溶液，把血細(xì)胞去除后，剪碎，加入1倍體積的0.1%的Ⅱ型膠原酶和0.125%胰蛋白酶，放在37℃的水浴中消化，期間每隔10 min搖晃一次，收集消化液，加入含有10%胎牛血清的DMEM混合后，種植到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞的貼壁時間差為60 min。將上清液吸除后，加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。取第3代細(xì)胞用于實驗。

1.2.2qRT-PCR檢測高糖作用后細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平 取第3代心肌成纖維細(xì)胞，分別用含有5.5 mmol/L的D葡萄糖和30 mmol/L的D葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為Control和HG。24 h后，加入Trizol，每個6孔板孔中加入1 ml的Trizol，充分裂解后。加入1/5體積(200 μl)三氯甲烷，充分混合后，4℃，12 000 r/min離心15 min。吸取上清溶液，加入等體積的異丙醇，在室溫條件下放置10 min，離心，把上清棄掉，用適量的75%乙醇洗滌后，晾干。用DEPC水溶解以后，紫外分光光度計檢測濃度、純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR檢測試劑盒檢測PTEN的水平，內(nèi)參基因為GAPDH，ΔΔCt法計算PTEN水平。PTEN上游引物：5′-TGACAGCCATCATGAAAGA-3′，下游引物：5′-CCGCTCTCATCAAAAGGTTCATTC-3′。GAPDH上游引物：5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′，下游引物：5′-GGGGTCATTGATAACAACAATA-3′。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.3Western blot檢測高糖作用后細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平 按照1.2.2中方法培養(yǎng)收集Control和HG細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，在冰上裂解50 min，4℃，16 000 r/min離心15 min，蛋白存在于上清中，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行定量檢測。蛋白樣品與5×上樣緩沖液按照4∶1的比例混勻后，100℃孵育5 min。每孔中加入40 μg蛋白，SDS-PAGE電泳初始電壓為80 V，電泳0.5 h以后，用120 V 繼續(xù)電泳。90 V，4℃轉(zhuǎn)膜90 min。5%牛血清白蛋白在室溫封閉60 min。加入1∶900稀釋的一抗4℃過夜后，加入1∶3 000稀釋的辣根過氧化物標(biāo)記的二抗室溫反應(yīng)1 h，DAB顯色，在暗室中曝光，Quantity one分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后，把細(xì)胞濃度調(diào)整到每毫升含有2×105個細(xì)胞，種植到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，觀察細(xì)胞融合度約為60%進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將pSicoR-PTEN和對照pSicoR用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，用含有5.5 mmol/L的D葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為PTEN和NC。轉(zhuǎn)染pSicoR-PTEN后的細(xì)胞經(jīng)含有30 mmol/L的D葡萄糖細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后記為PTEN+HG。Control和HG細(xì)胞處理方法同1.2.2。

1.2.5MTT檢測細(xì)胞增殖 Control、HG、PTEN+HG細(xì)胞以每孔加入5 000個細(xì)胞種植到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h以后，每孔中加入20 μl的濃度為5 mg/ml的噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)，在37℃孵育4 h。每組設(shè)置5個復(fù)孔。將上清吸除以后，每孔中加入二甲基亞砜溶液150 μl，避光，室溫反應(yīng)10 min。用酶標(biāo)儀檢測每孔490 nm的A值。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.6Western blot檢測STAT3、p-STAT3水平 Control、HG、PTEN+HG細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，Western blot檢測細(xì)胞中STAT3、p-STAT3水平，STAT3、p-STAT3一抗以1∶800和1∶500稀釋。步驟同1.2.3。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.7STAT3通路阻斷劑AG490對細(xì)胞增殖影響 轉(zhuǎn)染pSicoR-PTEN后的心肌成纖維細(xì)胞用含有30 μmol/L的STAT3通路阻斷劑AG490和含有30 mmol/L的D葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)記為PTEN+HG+AG490。 PTEN+HG、PTEN+HG+AG490細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，MTT檢測細(xì)胞增殖，Western blot檢測細(xì)胞中STAT3、p-STAT3水平。步驟同1.2.3和1.2.5。實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1高糖作用后心肌成纖維細(xì)胞中PTEN水平 如圖1和表1所示，Control、HG細(xì)胞中PTEN mRNA水平依次為：1.00±0.10、0.26±0.03，PTEN蛋白水平為：1.08±0.11、0.34±0.04。HG細(xì)胞中PTEN mRNA水平和蛋白水平均明顯低于Control，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t1=42.724,t2=10.951,P<0.05)。高糖作用后的心肌成纖維細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平下降。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PTEN表達(dá)水平 結(jié)果如圖2和表2所示，Control、NC、PTEN細(xì)胞中PTEN mRNA水平依次為：1.00±0.09、1.03±0.07、1.87±0.16，PTEN蛋白水平為：0.98±0.08、0.96±0.12、1.68±0.14。NC細(xì)胞中PTEN mRNA水平和蛋白水平與Control相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t1=0.364,t2=0.211,P>0.05)。PTEN細(xì)胞中PTEN mRNA水平和蛋白水平明顯高于Control，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t1=10.568,t2=7.388,P<0.05)。心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSicoR-PTEN后能夠提高細(xì)胞中PTEN基因和蛋白水平，轉(zhuǎn)染對照載體pSicoR對細(xì)胞中PTEN基因和蛋白水平?jīng)]有影響。

圖1 Western blot檢測高糖作用后細(xì)胞中PTEN水平Fig.1 Level of PTEN in cells after high glucose detected by Western blot

GroupsPTEN mRNAPTEN proteinControl1.00±0.101.08±0.11HG0.26±0.031)0.34±0.041)

Note：Vs control，1)P<0.05.

2.3PTEN對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖影響 如表3所示，Control、HG、PTEN+HG細(xì)胞A值依次為：0.32±0.04、0.54±0.06、0.41±0.04。HG細(xì)胞A值與Control相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.660,P<0.05)。PTEN+HG細(xì)胞A值明顯低于HG，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.344,P<0.05)。高糖誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖，PTEN可以減弱高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖作用。

2.4PTEN對高糖環(huán)境細(xì)胞中STAT3、p-STAT3水平影響 如圖3和表4所示，Control、HG、PTEN+HG細(xì)胞STAT3水平依次為：0.62±0.05、0.60±0.08、0.61±0.06，p-STAT3水平依次為：0.14±0.02、0.52±0.06、0.28±0.03。HG細(xì)胞p-STAT3水平與Control相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.516,P<0.05)。 PTEN+HG細(xì)胞p-STAT3水平明顯低于

圖2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PTEN蛋白水平Fig.2 Level of PTEN protein in transfected cells detected by Western blot

GroupsPTEN mRNAPTEN proteinControl1.00±0.090.98±0.08NC1.03±0.070.96±0.12PTEN1.87±0.161)1.68±0.141)F71.97137.455P0.0000.000

Note：Vs control,1)P<0.05.

GroupsA valueControl0.32±0.04HG0.54±0.061)PTEN+HG0.41±0.042)F16.191P0.004

Note：Vs Control,1)P<0.05；vs HG,2)P<0.05.

圖3 Western blot檢測 PTEN對細(xì)胞STAT3、p-STAT3水平影響Fig.3 Effect of PTEN on cell STAT3,p-STAT3 level detected by Western blot

GroupsSTAT3p-STAT3Control0.62±0.050.14±0.02HG0.60±0.080.52±0.061)PTEN+HG0.61±0.060.28±0.032)F0.07267.837P0.9310.000

Note：Vs Control,1)P<0.05；vs HG，2)P<0.05.

HG，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.273,P<0.05)。高糖誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞中STAT3磷酸化，PTEN降低高糖環(huán)境細(xì)胞中STAT3磷酸化水平。

2.5抑制STAT3信號通路對細(xì)胞增殖影響 結(jié)果見圖4和表5中所示，PTEN+HG、PTEN+HG+AG490細(xì)胞A值依次為：0.46±0.04、0.35±0.03，STAT3水平依次為：0.84±0.08、0.86±0.09，p-STAT3水平依次為：(0.23±0.02)、(0.11±0.01)。PTEN+HG+AG490細(xì)胞p-STAT3水平和A值明顯降低，與PTEN+HG相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t1=3.811,t2=9.295,P<0.05)。抑制STAT3信號通路可以進(jìn)一步降低心肌成纖維細(xì)胞增殖能力，其與PTEN具有協(xié)同作用，可以抑制高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖。

圖4 Western blot檢測各組細(xì)胞中STAT3、p-STAT3水平Fig.4 STAT3，p-STAT3 levels of cells in each group detected by Western blot

GroupsA valuep-STAT3STAT3PTEN+HG0.46±0.040.23±0.020.84±0.08PTEN+HG+AG4900.35±0.031)0.11±0.011)0.86±0.09

Note：Vs PTEN+HG,1)P<0.05.

3 討論

人類PTEN基因定位于染色體10q23，其由8個內(nèi)含子、9個外顯子組成，其編碼的蛋白質(zhì)由403個氨基酸組成，在細(xì)胞漿、細(xì)胞核和細(xì)胞膜均有表達(dá)，其含有的PDZ結(jié)構(gòu)域能夠特異性的識別PDZ基序蛋白，從而調(diào)控三磷酸磷脂酰的活性，影響細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10-12]。PTEN與心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生有關(guān)，與心力衰竭、心肌收縮、心肌缺血再灌注、糖尿病心肌病等關(guān)，其編碼的蛋白質(zhì)具有蛋白和脂質(zhì)磷酸酶活性，能夠抑制細(xì)胞的生長[13,14]。研究顯示，PTEN在心肌肥厚大鼠模型中表達(dá)上調(diào)，是一種抗心肌肥厚因子，基因敲除PTEN的小鼠心臟的外觀變大，出現(xiàn)明顯的心肌纖維化[15,16]。付興根等[17]在研究螺內(nèi)酯對糖尿病心肌病大鼠的影響時發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病大鼠心肌組織中的PTEN mRNA和蛋白水平明顯低于正常大鼠，PTEN參與糖尿病心肌病發(fā)生過程。本研究結(jié)果顯示，高糖作用后的心肌成纖維細(xì)胞中PTEN水平下降，心肌成纖維細(xì)胞增殖能力增加，這與上述報道相符合，說明PTEN參與糖尿病心肌病的發(fā)生過程。

STAT3能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，在心力衰竭、缺血再灌注等中具有保護(hù)作用，在糖尿病心肌病中過度激活[18-20]。STAT3是STATs家族中的一員，而STATs家族與細(xì)胞增殖、分化、生長、凋亡等有關(guān)，是目前研究最多的信號通路之一，STAT3蛋白大小為89～92 kD，其含有多個結(jié)構(gòu)域，如：DNA結(jié)合區(qū)域、螺旋區(qū)域、連接區(qū)域、C端轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域和SH2結(jié)構(gòu)域等，正是由于這些結(jié)構(gòu)域，其在細(xì)胞正常生物學(xué)特性維持中具有重要作用[21-25]。STAT3在受到細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)因子作用后，STAT3磷酸化，而2個磷酸化的STAT3可以形成二聚體后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮信號傳遞的作用[26-28]。STAT3與糖尿病心肌病有關(guān)，無論是在Ⅰ型糖尿病還是Ⅱ型糖尿病中均發(fā)現(xiàn)STAT3信號通路異常，并且與間質(zhì)纖維化等有關(guān)，在高糖作用后的心肌成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)p-STAT3水平升高[27,29]。PTEN和STAT3作為重要的調(diào)控細(xì)胞生長因子，二者之間也存在一定的聯(lián)系[30]。

本研究結(jié)果顯示，心肌成纖維細(xì)胞經(jīng)高糖作用后，細(xì)胞中的STAT3磷酸化水平升高，而PTEN表達(dá)水平升高后，經(jīng)高糖誘導(dǎo)后的細(xì)胞中STAT3磷酸化有所降低。進(jìn)一步用STAT3信號通路抑制劑處理后發(fā)現(xiàn)，抑制STAT3信號通路和過表達(dá)PTEN具有協(xié)同作用，都能夠抑制高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖，說明PTEN通過抑制STAT3信號通路降低高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖能力。

綜上，高糖誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平，過表PTEN后可以降低高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖水平，作用機(jī)制與抑制STAT3信號通路有關(guān)。本研究明確了PTEN在高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖中的作用，為探討糖尿病心肌病及心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究存在一定的局限性，只在心肌成纖維細(xì)胞中進(jìn)行了探討，后續(xù)試驗中會繼續(xù)探討PTEN在心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞中的作用。

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