苗華榮，楊偉強，胡曉輝，張勝忠，崔鳳高，陳 靜

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

栽培種花生(A.hypogaeaL.)為異源四倍體，是世界上重要的油料作物，廣泛分布于世界半干旱區(qū)域。2010-2014年，全球種植面積為25.27百萬hm2，產(chǎn)量達到42.27百萬t[1]。分子遺傳圖譜廣泛應(yīng)用于基因定位、圖位克隆以及分子標記輔助育種。目前，遺傳圖譜通常包含RFLP、AFLP、SSR、SNP標記。自2001年以來，共27個四倍體花生遺傳連鎖圖譜公布，其中23個遺傳圖譜是基于栽培種花生構(gòu)建的，4個是栽培種花生與合成四倍體花生構(gòu)建的[2-17]?；谶z傳圖譜，花生重要性狀的QTL定位取得了一定進展，張新友[18]運用栽培種RIL群體和F2群體定位了與產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀相關(guān)的62個QTL；Shirasawa等[12]基于栽培種花生遺傳圖譜，獲得了與開花日期、分枝角度、主莖高、莢果長、莢果厚、莢果寬的QTL；Wang等[19]利用栽培種花生Tifrunner×GT-C20構(gòu)建的群體定位到與番茄斑萎病毒(TSWV)、葉斑病相關(guān)的QTL；Huang等[8]利用RIL群體對3個環(huán)境下花生株高進行了QTL分析；Pandey等和Wang等[9，20]分別利用SunOleic97R×NC94022和Tifrunner×GT-C20構(gòu)建的RIL群體對花生脂肪酸和油脂含量進行了QTL分析；成良強等[21]利用富川大花生×ICG6375構(gòu)建的F2群體和F3家系對花生主莖高和總分枝數(shù)進行了QTL分析。

目前，花生耐鹽性研究主要集中在不同耐鹽鑒定方法的探索[22-23]、花生耐鹽性種質(zhì)資源鑒定和評價[24]、鹽脅迫下花生生理特性變化以及鹽脅迫對花生品質(zhì)影響等方面[25-26]，但是對花生耐鹽分子遺傳機理的研究鮮見報道。本研究利用花育28號和P76構(gòu)建的RIL群體，對2013，2014年2個年份鹽脅迫下的表型進行調(diào)查，基于構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖譜，開展花生鹽脅迫下相關(guān)性狀的QTL分析，對花生耐鹽基因的挖掘具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以花育28號和P76為親本構(gòu)建的RIL群體為試材?；ㄓ?8號由山東省花生研究所育成，通過了山東省農(nóng)作物品種審定委員會審定；P76為來源于山東省花生研究所的高油酸品系，RIL群體包含146個株系。2013年(F2∶9)和2014年(F2∶10)材料種植于山東省花生研究所試驗站，2013，2014年收獲后晾干備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 幼苗期耐鹽性鑒定 選取親本和RIL群體各株系飽滿種子40粒于雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于黑暗條件下人工培養(yǎng)箱(28～30 ℃)中進行培養(yǎng)，3 d后選擇芽長約2 cm生長狀況良好且相對一致的花生種子移栽至2組裝滿純水的花生種子發(fā)芽盒A、B中，放置在人工氣候室內(nèi)，在29 ℃條件下培養(yǎng)至幼苗長成“兩葉一心”后對A、B這2組進行處理，種子發(fā)芽盒中溶液的鹽濃度分別為0，0.75%，之后每2 d換一次鹽溶液和純水，處理7～9 d后從A、B 2組中各挑選不同株系的長勢大致相同的花生幼苗3株為樣本進行測量，測定各株高、主根長、莖葉干質(zhì)量、根干質(zhì)量、莖葉鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量；重復(fù)3次。

花生耐鹽性指標：耐鹽指數(shù)=鹽處理值/對照值。將各指標轉(zhuǎn)化為相對值；利用Excel對各耐鹽堿指標進行分析。

1.2.2 圖譜構(gòu)建和QTL分析 利用RIL群體構(gòu)建了包含2 334個標記的高密度遺傳圖譜，該圖譜包含68個SSR標記和2 266個SLAF標記，覆蓋全基因組圖距為2 586.37 cM，分布于20個連鎖群，標記間的平均距離為2.25 cM。應(yīng)用完備區(qū)間作圖軟件IciMapping v3.0(http：//www. isbreeding.net/)[27]對表型值進行QTL分析。LOD閾值經(jīng)1 000次模擬計算后得到，其中將 LOD 值低于 2.5 的 QTL 忽略，以增加 QTL 檢測的準確性與可靠性。

QTL 命名方法按照 QTL+性狀+群體名稱+染色體+QTL 數(shù)。其中，QTL 以 q 表示，性狀和群體以英文縮寫表示，染色體以花生染色體表示，染色體上 QTL 數(shù)目以數(shù)字表示，性狀與群體名稱間加“-”，群體名稱和染色體間加“-”，染色體和 QTL 數(shù)間加“.”。如qSmsh-HP-A10.1表示A10 染色體上鹽脅迫株高(SMSH)的 QTL，HP為花育28號×P76構(gòu)建的 RIL 群體的縮寫，1 表示該染色體上的第一個鹽脅迫株高的 QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼苗期耐鹽性相關(guān)性狀的表型變異

在0.75%鹽濃度條件培育下，花育28號和P76各測定指標的絕對值和相對值表現(xiàn)有一定差異(表1)。鹽脅迫下花育28號株高、主根長(2013年除外)、莖葉干質(zhì)量、根干質(zhì)量、莖葉鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量的相對值均高于P76。各指標的偏度和峰度絕對值表現(xiàn)有差異，鹽脅迫下根干質(zhì)量(2014年)絕對值的峰度為3.72，其他指標的峰度絕對值均小于1或接近1；鹽脅迫下根系相關(guān)指標相對值的峰度偏高，而地上指標相對值的峰度較低；這些性狀表現(xiàn)為連續(xù)變異，每個性狀都表現(xiàn)超親分離，且多數(shù)性狀頻數(shù)分布基本符合正態(tài)分布；表明為多基因控制的數(shù)量性狀，適合進行 QTL 定位分析。

2.2 幼苗期耐鹽性相關(guān)性狀 QTL 分析

表1 RIL 群體及其親本的鹽脅迫相關(guān)性狀在不同環(huán)境下的表現(xiàn)Tab.1 Evaluation of traits related to salt stress of the RIL populations and their parents in different environments

利用IciMapping對鹽脅迫下各表型絕對值進行分析，獲得13個相關(guān)的QTL，分布于10個連鎖群上。其中，株高相關(guān)的QTL 3個：qSmsh-HP-A10.1、qSmsh-HP-B02.1和qSmsh-HP-B05.1分別位于A10、B02和B05染色體，解釋的表型變異分別是4.13%，4.79%和6.69%，加性效應(yīng)分別為0.36，0.40和-0.44，其中qSmsh-HP-A10.1、qSmsh-HP-B02.1的增效等位基因來源于花育28號，qSmsh-HP-B05.1的增效等位基因來源于P76。主根長相關(guān)的QTL 2個：qSrl-HP-A03.1和qSrl-HP-A06.1分別位于A03、A06染色體，解釋的表型變異分別是5.63%，4.17%，加性效應(yīng)分別為0.32，0.21，二者的增效等位基因來源于花育28號。莖葉干質(zhì)量相關(guān)的QTL 2個：qSwdp-HP-A08.1和qSwdp-HP-A07.1分別位于A08、A07染色體，解釋的表型變異分別是4.99%，3.08%，二者的增效等位基因來源于花育28號。莖葉鮮質(zhì)量相關(guān)的QTL 4個：qSwfp-HP-A04.1、qSwfp-HP-B02.1、qSwfp-HP-B03.1、qSwfp-HP-B07.1分別位于A04、B02、B03和B07染色體，解釋的表型變異分別是6.13%，5.73%，6.88%和5.30%，qSwfp-HP-A04.1的增效等位基因來源于P76，qSwfp-HP-B02.1、qSwfp-HP-B03.1、qSwfp-HP-B07.1的增效等位基因來源于花育28號。根鮮質(zhì)量相關(guān)的QTL個：qSwfr-HP-B03.1、qSwfr-HP-B03.2均位于B03染色體，解釋的表型變異分別是2.81%，3.12%，二者的增效等位基因來源于花育28號。

對鹽脅迫下各指標相對值進行分析表明，檢測到株高相對值相關(guān)的QTL 3個：qRmsh-HP-A06.1、qRmsh-HP-B02.1和qRmsh-HP-B04.1分別位于A06、B02和B04染色體，解釋的表型變異分別是3.01%，2.80%和3.47%，其增效等位基因均來源于花育28號。檢測到主根長相對值相關(guān)的QTL 2個：qRrl-HP-A08.1、qRrl-HP-B06.1分別位于A08、B06染色體，解釋的表型變異分別是16.72%，22.42%，其增效等位基因來源于P76。檢測到莖葉鮮質(zhì)量相對值相關(guān)的QTL 1個：qRwfp-HP-B02.1位于B02染色體，解釋的表型變異分別是5.43%，其增效等位基因來源于花育28號。

對比發(fā)現(xiàn)，在B02染色體上檢測到4個QTL(表2、圖1)，分別為qSmsh-HP-B02.1、qSwfp-HP-B02.1、qRmsh-HP-B02.1、qRwfp-HP-B02.1，其控制鹽脅迫下絕對株高、相對株高、絕對莖葉鮮質(zhì)量和相對莖葉鮮質(zhì)量，qSmsh-HP-B02.1、qSwfp-HP-B02.1、qRwfp-HP-B02.1兩端的標記為Ah1TC1B02和Marker774175，qRmsh-HP-B02.1兩端的標記為Marker774175和Marker911824，4個QTL的增效等位基因均來源于花育28號。

表2 鹽脅迫相關(guān)性狀的 QTL 檢測結(jié)果Tab.2 QTLs for traits related to salt stress

圖1 鹽脅迫下絕對株高、相對株高、絕對莖葉鮮質(zhì)量和相對莖葉鮮質(zhì)量相關(guān)QTL在全基因組上的分布Fig.1 QTL overviews of absolute and relative value of main stem height and shoot fresh weight on salt stress

3 討論與結(jié)論

花生生長的各個時期耐鹽性表現(xiàn)不同。吳蘭榮等[23]對花生全生育期進行耐鹽性鑒定，表明花生芽期和幼苗期是對鹽害最敏感時期，花生芽期耐鹽性與后期耐鹽性無明顯相關(guān)。因此，本試驗將幼苗期作為花生耐鹽性重要時期進行QTL定位。根據(jù)前期大量不同鹽濃度處理結(jié)果，選用0.75%鹽濃度作為水培條件下花生耐鹽性鑒定濃度。對于花生耐鹽性鑒定指標，慈敦偉等[22]采用盆栽試驗，開展花生苗期耐鹽性評價及耐鹽指標篩選，認為地上部形態(tài)和生物量可作為耐鹽評價的首選指標，而主根長和出苗速度可作為輔助指標用以判斷花生品種的綜合耐鹽能力。本研究選用鹽脅迫下主莖高、莖葉鮮質(zhì)量、莖葉干質(zhì)量、主根長、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量作為調(diào)查指標研究花生的耐鹽性。

花生耐鹽性分子生物學(xué)的研究集中于轉(zhuǎn)外源基因?qū)τ诨ㄉ望}性影響和花生耐鹽相關(guān)基因的克隆。王亞等[28]通過花粉管通道法，將攜帶條斑紫菜PyTPS基因的pCAMBIA2300-PyTPS重組載體導(dǎo)入花生；宗自衛(wèi)等[29]將甜茶堿BADH基因轉(zhuǎn)入花生；表明轉(zhuǎn)基因植株比對照植株耐鹽性有所提高。王寶枝[30]克隆出了花生中的2種耐鹽基因液泡膜 Na+/H+逆轉(zhuǎn)運蛋白NHX1 基因和多胺生物合成中的一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶SAMDC基因；Chen等[31]通過序列分析及同源性比對方法從花生已有cDNA文庫中篩選到6個AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因，并獲得其全長，轉(zhuǎn)基因擬南芥表明，AhERF6轉(zhuǎn)入擬南芥中能夠增強轉(zhuǎn)基因植株鹽脅迫下鹽脅迫相關(guān)關(guān)鍵基因的表達。而目前關(guān)于花生耐鹽性QTL的研究尚未見報道。本研究檢測到13個鹽脅迫下各指標絕對值相關(guān)的QTL，分布于10個連鎖群上；檢測到6個鹽脅迫下各指標相對值相關(guān)的QTL。在B02染色體上檢測到1個QTL熱點區(qū)，包含4個QTL：qSmsh-HP-B02.1、qSwfp-HP-B02.1、qRmsh-HP-B02.1、qRwfp-HP-B02.1，控制鹽脅迫下株高和莖葉鮮質(zhì)量，其貢獻率分別4.79%，5.73%，2.80%和5.43%，增效等位基因均來源于花育28號，qRmsh-HP-B02.1兩端標記為Marker774175和Marker911824，其他3個QTL兩端標記為Ah1TC1B02和Marker774175。這種熱點區(qū)對于深入研究花生耐鹽機制具有重要意義。

本研究基于RIL群體表型數(shù)據(jù)和高密度遺傳圖譜，檢測到19個鹽脅迫下相關(guān)的QTL。檢測到1個QTL熱點區(qū)，位于B02染色體，包含4個QTL：qSmsh-HP-B02.1、qSwfp-HP-B02.1、qRmsh-HP-B02.1、qRwfp-HP-B02.1，鹽脅迫下株高和莖葉鮮質(zhì)量，增效等位基因均來源于花育28號。這種熱點區(qū)對于深入研究花生耐鹽機制具有重要意義。

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