張海月，肖玉雄，田義軻，王彩虹，楊紹蘭，李 昱，李玉琪

(青島農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，青島市園藝植物遺傳改良與育種重點實驗室，山東 青島 266109)

蘋果樹體形狀一般分為柱型、短枝型、普通型和下垂型，其中柱型的矮化程度最高，表現(xiàn)為節(jié)間短、腋芽萌發(fā)產(chǎn)生大量短側(cè)枝，很少或無側(cè)生延長新梢，冠形極其緊湊，非常適合高密度種植。因此，該性狀形成的機制一直是眾多學者研究的熱點。

微管是細胞骨架的重要組成成分，是由亞單位α/β微管蛋白(α/β-tubulin)異二聚體形成原絲，然后裝配成中空的管狀結(jié)構(gòu)[1]。微管對植物的正常生長發(fā)育具有重要作用，主要參與了植物細胞生長的關(guān)鍵過程，包括細胞的分裂和形態(tài)建成[2-3]。例如，微管的聚集能夠促進植物頂端的生長[4]，通過調(diào)節(jié)纖維素微纖維的沉積方向參與細胞壁的形成過程，影響細胞壁的組分和結(jié)構(gòu)，進而影響細胞的伸長[5-7]。微管還影響被子植物花粉管的生長[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，植物體中微管的減少、變短和分離都能導致植株的矮化[9]。微管還廣泛參與調(diào)節(jié)植物的生物和非生物脅迫[10-11]，并對維持高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器的形態(tài)和功能具有重要作用[12-13]。

植物中的微管蛋白氨基酸序列相似性極高[14]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.)[15]、毛果楊(PopulustrichocarpaTorr.&Gray)[16]、玉米(ZeamaysL.)[17-18]、水稻(OryzasativaL.)[19]、梨(Pyrusspp.)[20]、亞麻 (LinumusitatissimumL.)[21]、柳(SalixbabylonicaL.)[22-23]等植物上已報道了大量的微管蛋白基因。目前，蘋果上還未見有關(guān)微管蛋白基因的報道。

前期研究中，青島農(nóng)業(yè)大學果樹育種課題組從西洋梨基因組中鑒定了一組β-微管蛋白基因，有7個基因在莖尖組織中表達。其中，定位于chr16上的轉(zhuǎn)錄本號為PCP044487.1的基因在矮生型和普通型梨莖尖中的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著，推測該基因可能與梨矮生性狀形成的分子調(diào)控有關(guān)[20]。在蘋果基因組中搜索發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄本號為MDP0000749824.1的蛋白與PCP044487.1相似性最高。本研究欲以柱型蘋果品種舞姿和普通型蘋果品種煙富3號為代表，探討該基因在這2種不同株型上的表達特征，同時，對該基因及其啟動子序列特征進行分析，為進一步深入研究該基因的功能提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

2017年5月中旬，在田間選取5年生的普通型蘋果品種煙富3號和柱型蘋果品種舞姿各3株(即3次重復)，基砧均為八棱海棠，選取旺盛生長的梢端組織(長度約為0.5 cm)，投入液氮速凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選取幼嫩的本氏煙草葉片用于亞細胞定位研究。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 采用北京原平皓生物技術(shù)有限公司的EASYspin植物RNA快速提取試劑盒提取莖尖總RNA。采用Fermentas公司的RevertAid First-strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應，具體步驟參考試劑盒說明書。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋20倍用于qRT-PCR分析。

1.2.2MDP0000749824.1基因在2個不同株型蘋果品種莖尖中的轉(zhuǎn)錄水平分析 從蘋果基因組數(shù)據(jù)庫(https：//www.rosaceae.org/species/malus/all)序列，據(jù)此設計qRT-PCR分析用引物(F：5′-GGTCATGTTTAGGAGGAAGG-3′；R：5′-CCAGCTCTTCCTCATCATAC-3′)。以蘋果Actin(GenBank登錄號：XM_017335931.1)作為內(nèi)參基因(F：5′-CCAAAGGCTAATCGGGAGAAA-3′；R：5′-ACTGGCGTAGAGGGAAAGAACA-3′)。引物由上海生工公司合成。轉(zhuǎn)錄水平在實時熒光定量PCR儀Light Cycler?480Ⅱ(Roche)上分析。qRT-PCR采用10 μL體系，包含1×LightCycler 480 Green Ⅰ Master(Roche)5.0 μL、模板cDNA 1.0 μL、正、反向引物(0.25 μmol/L)各0.5 μL、2.0 mmol/L MgCl23.0 μL。反應條件是95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共進行45個循環(huán)。PCR結(jié)束后，先升溫至95 ℃ 5 s，再降溫至65 ℃ 1 min，然后升溫到97 ℃。在65～97 ℃的升溫過程中收集熒光(每變化0.2 ℃收集1次熒光)。待溫度冷卻至40 ℃終止反應。每個反應3次重復。使用2-ΔΔCt方法[24]對熒光值的變化曲線進行分析，計算目的片段的轉(zhuǎn)錄水平。用SPSS軟件對轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析。

1.2.3MDP0000749824.1基因CDS序列克隆及特征分析 根據(jù)下載的CDS序列信息設計1對PCR引物(F：5′-ATGAGAGAAATCTTGCAC-3′；R：5′-TCAGTTCTCCAGCTCTTCCT-3′)，以煙富3號、舞姿莖尖RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴增程序為95 ℃預變性5 min；然后依次進行95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；最終在72 ℃下終延伸10 min。從1%的瓊脂糖凝膠上用試劑盒Agrose Gel DNA Recovery Kit Ver.2.0(TaKaRa)回收目的基因。將回收產(chǎn)物連接到pMD?18-T Simple Vector載體上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coliDH5α，然后進行測序，以獲取該基因的全長CDS序列。用DNAMAN軟件進行序列比對分析。

在蘋果基因組數(shù)據(jù)庫Apple Gene Set(https：//www.rosaceae.org/species/malus/all)中搜索該基因序列，分析其外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)特點，并進行相應的染色體定位。

1.2.4 MDP0000749824.1蛋白理化性質(zhì)及其進化分析 用在線軟件Protparam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析蛋白理化性質(zhì)；用SOMPA(http：//www.expasy.ch/tools)和Phyre2在線軟件(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)對蛋白二級與三級結(jié)構(gòu)進行分析；將MDP0000749824.1與NCBI中提交的梨、桃、油菜、擬南芥、水稻、高粱和玉米等物種的β-微管蛋白氨基酸序列進行比對分析，使用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 MDP0000749824.1蛋白亞細胞定位 利用得到的蘋果MDP0000749824.1全長CDS序列，通過引物(Up-5′-GGATCCATGGGGAGGGGAAAG/CCCAAGATGAAGGGCCGT-3′-Dn)引入酶切位點KpnⅠ和XbaⅠ，以煙富3號蘋果cDNA為模板進行PCR擴增。擴增程序：95 ℃變性3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。使用Agrose Gel DNA Recovery Kit Ver.2.0(TaKaRa)膠回收試劑盒回收目的條帶。用KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切Cam35S-GFP空載體后，將所回收的目的片段和Cam35S-GFP空載體用重組連接酶連接，獲得Cam35S-MDP0000749824-GFP重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞(Amp+)后進行菌落PCR檢測，挑取陽性菌落用于測序驗證。將融合載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，在幼嫩的煙草葉片進行瞬時表達。使用激光共聚焦顯微鏡FV10-ASW(OLYMPUS)觀察綠色熒光定位情況。

1.2.6 啟動子克隆及序列分析 采用植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根)提取基因組DNA。在蘋果基因組中截取MDP0000749824.1基因編碼序列上游約1 600 bp的參考序列，據(jù)此設計引物(F：5′-ACTTATCTGGAAATCACGCTCTT-3′；R：5′-GTTCCCACATTGTCCAG-3′)。分別以舞姿和煙富3號的DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系、擴增程序和后續(xù)的克隆轉(zhuǎn)化以及測序分析等同1.2.3。利用在線軟件PlantCare(http：//bioinformatics.Psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對啟動子的順式作用元件進行預測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDP0000749824.1在2個具有不同株型蘋果品種莖尖中的轉(zhuǎn)錄水平比較

實時熒光定量PCR技術(shù)分析檢測結(jié)果表明，MDP0000749824.1在柱型蘋果品種舞姿莖尖中的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于普通型蘋果品種煙富3號，后者約是前者的3.8倍(圖1)。

T.舞姿(柱型)；YF3.煙富3號(普通型)；不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)。圖7同。T.Telamon(Colummar type)；YF3.Yanfu 3(Standard type)；Different lowercase letters mean significant difference at P≤0.05.The same as Fig.7.

2.2 MDP0000749824.1基因結(jié)構(gòu)與染色體定位

以柱型蘋果品種舞姿及普通型蘋果品種煙富3號新梢莖尖組織cDNA為模板，經(jīng)MDP0000749824.1 CDS特異性引物PCR擴增后，均獲得一段1 332 bp核苷酸序列。在蘋果基因組中搜索發(fā)現(xiàn)，該基因位于16號染色體上(Chr16：16834724-16836980)(圖2)，整個基因含有3個外顯子和2個內(nèi)含子(圖3)。DNAMAN比對結(jié)果表明，煙富3號和舞姿上該基因的編碼序列完全一致。

2.3 MDP0000749824.1蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

MDP0000749824.1基因編碼一個含有443個氨基酸的蛋白質(zhì)，含有植物β-微管蛋白的保守序列，包括微管蛋白GTP結(jié)合位點片段GGGTGSG和磷酸化位點片段MREI(圖4)。

圖2 MDP0000749824.1在蘋果基因組中染色體上的位置Fig.2 Chromosome position of MDP0000749824.1 in apple genome

在線軟件ProtParam分析顯示，MDP0000749824.1編碼蛋白的分子式為C2192H3371N597O676S33，蛋白分子質(zhì)量為49.96 ku，等電點pI為4.90，其中包含帶正電殘基(Arg+Lys)36個，帶負電殘基(Asp+Glu)57個。進一步分析表明，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為31.74，脂肪系數(shù)為71.06，平均親水性系數(shù)為-0.349。MDP0000749824.1蛋白親水性分析發(fā)現(xiàn)，其C端偏向疏水性，N端偏向親水性，親水性與疏水性交替出現(xiàn)在該蛋白的中間部分，其中，達-2.0以下的親水峰有9處，達2.0以上的疏水峰有2處。

數(shù)字代表堿基數(shù)量。 Numbers represent the base length.

圖4 MDP0000749824.1基因編碼的氨基酸序列Fig.4 Amino acid sequence encoded by gene MDP0000749824.1

利用SOPMA在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，MDP0000749824.1蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋所占比例最大，為39.50%；不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)次之，比例為29.12%；β轉(zhuǎn)角最少，僅為11.29%。用Phyre2預測MDP0000749824.1的三級結(jié)構(gòu)的覆蓋度為96%。

2.4 MDP0000749824.1蛋白亞細胞定位

克隆MDP0000749824.1全長CDS序列，構(gòu)建了Cam35S-MDP0000749824.1-GFP融合載體，并將其轉(zhuǎn)入煙草葉片上皮細胞中，激光共聚焦顯微鏡下的觀察結(jié)果顯示，該蛋白定位在細胞膜和微管中(圖5)。

UV.綠色通道；DIC.明場通道；Merge.綠色和明場重疊通道；1.Cam35S-MDP0000749824.1-GFP煙草上皮細胞瞬時表達；2.空白對照。UV.Green channel；DIC.Bright field channel；Merge.Overlays of green and bright field channel；1.Transient expression of Cam35S-MDP0000749824.1-GFP fusion protein in tobacco epidermis cells；2.Postive control.

2.5 蛋白序列進化分析

將來自不同物種的高度同源的26條蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘋果的MDP0000749824.1與白梨(XP 009364903.1)、梅(XP 008220629.1)、碧桃(XP 007211186.1)等薔薇科木本植物的相似性較大，而與玉米(NP 001167651.1)、水稻(pir||JC2510)、高粱(XP 002456503.2)、小立碗蘚(XP 001767462.1)、擬南芥(NP 196786.1)等非木本植物的相似性較低(圖6)。

圖6 蘋果MDP0000749824.1與其他物種同源蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.6 Phylogenetic relationship among MDP0000749824.1 and other homologous proteins

2.6 啟動子序列比對與順式作用元件分析

分別以舞姿及煙富3號的DNA為模板，用啟動子特異性引物PCR擴增后，均獲得一段1 661 bp的核苷酸序列，二者有6處堿基差異(圖7)。通過Neural Network Promoter Prediction軟件(http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)在線預測該啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點為翻譯起始密碼子上游700 nt的A堿基。序列中除存在多數(shù)啟動子具有的基本轉(zhuǎn)錄元件外，還發(fā)現(xiàn)了一些順式調(diào)控元件，如赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯和水楊酸等激素響應元件，分生組織表達相關(guān)順式調(diào)控元件和光調(diào)控元件等(表1)。然而，這6處差異均不在預測的調(diào)控元件位置。

方框內(nèi)代表啟動子上的順式作用元件；TSS.轉(zhuǎn)錄起始位點；M.起始密碼子。The boxes represent the promoter cis-acting elements.TSS.Transcription start site；M.Start codon.

元件Motif位置(±鏈)Distance from ATG(±strand)元件序列Motif sequence功能Function5′UTR Py-rich stretch1 379(+)1 402(+)TTTCTTCTCTTTTCTTCTCT高轉(zhuǎn)錄水平順式作用元件ABRE902(-)904(-)CGTACGTGCATACGTGABA響應順式作用元件AE-box434(-)AGAAACAT部分光響應模塊ARE398(-)TGGTTT厭氧誘導必需的順式作用調(diào)控元件ATCT-motif214(+)AATCTAATCT光調(diào)控元件Box 4353(+)967(-)ATTAATATTAAT光調(diào)控元件Box Ⅰ237(-)TTTCAAA光響應元件CAT-box1 235(+)GCCACT分生組織表達相關(guān)順式調(diào)控元件CATT-motif558(-)GCATTC部分光響應元件CGTCA-motif520(+)CGTCA茉莉酸甲酯響應順式調(diào)控元件G-Box904(+)904(-)CACGTA參與光響應順式作用調(diào)控元件GAG-motif153(+)264(-)GGAGATGAAACAGA光調(diào)控元件GARE-motif1 014(+)299(-)AAACAGAAAACAGA赤霉素響應元件GT1-motif359(-)693(-)GGTTAAGGTTAA光調(diào)控元件HSE279(+)AAAAAATTTC熱脅迫響應順式作用元件I-box630(-)GATATGG光調(diào)控元件LAMP-element1 196(+)CCTTATCCA光調(diào)控元件MBS828(+)CAACTG參與干旱誘導的MYB結(jié)合位點Skn-1-motif772(+)1 014(-)929(+)1 146(-)GTCATGTCATGTCATGTCAT胚乳表達必需的順式作用調(diào)控元件TATC-box987(-)1 135(-)TATCCCATATCCCA赤霉素響應順式調(diào)控元件TC-rich repeats801(-)ATTTTCTTCA防御與脅迫響應順式作用元件TCA-element1 378(-)GAGAAGAATA參與水楊酸響應順式作用元件TGACG-motif520(-)TGACG茉莉酸甲酯響應順式調(diào)控元件Unnamed_2178(-)AACCTAACCTCircadian523(+)CAAGTCAATC晝夜節(jié)律調(diào)控有關(guān)的順式調(diào)控元件

3 討論

柱型蘋果因極其緊湊的生長習性，非常適合高密度種植。因此，蘋果柱型性狀形成的生理機制以及分子機制一直是眾多學者探討的熱點問題[25-33]。

微管作為細胞骨架的重要組成，對植物的生長發(fā)育是有重要影響的。微管蛋白不僅在保持細胞的形態(tài)方面起支撐作用，而且對細胞壁的形成也起到了決定性作用，同時，還參與了細胞運動與細胞內(nèi)物質(zhì)運輸。因此，微管蛋白的合成會直接影響到細胞的生長與分裂，因而可能會對莖的伸長生長造成影響。本試驗通過同源克隆的方法獲得了蘋果微管蛋白基因MDP0000749824.1的CDS和啟動子序列。通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，MDP0000749824.1基因在柱型蘋果品種舞姿莖尖中的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于普通型蘋果品種煙富3號。但序列比對分析表明，這2個品種中，該基因的編碼序列沒有差異。盡管二者在啟動子序列上檢測到6處堿基差異，但均不在重要調(diào)控元件位置?？梢?，該基因的表達差異不應該是由于兩品種間其特異的序列差異引起的，而極有可能是受到了柱型基因調(diào)控的影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MDP0000749824.1基因啟動子序列上存在多個與脫落酸、赤霉素、茉莉酸甲酯和水楊酸等激素調(diào)節(jié)相關(guān)的元件。前人研究發(fā)現(xiàn)，柱型蘋果莖尖中自由型IAA和CTK的含量明顯高于普通型蘋果，且柱型蘋果莖尖組織中的活性赤霉素含量明顯偏低[34-38]，可見，柱型性狀的形成與激素調(diào)控密切相關(guān)。因此，該基因在2個品種上的轉(zhuǎn)錄水平差異可能是由2種不同株型間的內(nèi)源激素水平差異導致的。

蘋果柱型性狀產(chǎn)生的根源取決于位于10號染色體上的Co基因，圍繞該基因的分離鑒定盡管已經(jīng)作了大量的研究[28-29，33]，但目前仍難給出最終的定論。柱型表型應該是受Co基因牽動的一個分子網(wǎng)絡調(diào)控的綜合效應。根據(jù)本研究結(jié)果，筆者推測，β-微管蛋白基因MDP0000749824.1是位于Co調(diào)控網(wǎng)絡中的一個重要成員，Co基因是通過對內(nèi)源激素的影響，使該微管蛋白的合成受阻，最終影響到了莖的伸長，致使節(jié)間變短，植株矮化。關(guān)于這個問題，筆者將進一步設計研究方案，并作進一步的深入探討。

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