周冬梅，孔靈菲

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽 110001）

支氣管哮喘是一種涉及基因和環(huán)境相互作用的復(fù)雜疾病，病因仍不完全清楚。氣道上皮細胞在肺內(nèi)環(huán)境和外部環(huán)境之間提供了重要的保護層，支氣管上皮中表達的多個基因的多態(tài)性均與哮喘易感性相關(guān)［1］，而環(huán)境因素可能影響表觀遺傳機制，改變上皮細胞功能和對環(huán)境污染的反應(yīng)。詳細了解氣道上皮細胞的調(diào)節(jié)作用，有助于肺部疾病的進一步診治。大量的研究［2］表明，哮喘患者的氣道上皮細胞存在功能障礙，它在哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。氣道上皮屏障功能損傷的嚴(yán)重程度與支氣管哮喘急性發(fā)作的嚴(yán)重程度相關(guān)。近期研究［3］發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘患者的氣道上皮細胞存在自噬功能障礙。哮喘患者的肺組織電鏡檢查亦顯示，哮喘患者的氣道上皮細胞內(nèi)可見許多雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體［4］。本研究旨在檢測N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）能否調(diào)控支氣管哮喘小鼠氣道上皮細胞的自噬水平。

1 材料與方法

1.1 模型的制備與處理

將18只SPF級BALB/C小鼠分為磷酸鹽 （phosphate buffer saline，PBS） 對照組 （PBS組）、卵清白蛋白 （ovalbumin，OVA） 支氣管哮喘組 （OVA組） 及NAC治療組 （NAC組） ，每組6只，由遼寧長生生物有限公司提供。支氣管哮喘小鼠于第1天、第8天、第15天腹腔注射OVA （美國Sigma公司） 20 μ g與氫氧化鋁凝膠（美國Pierce公司） 2 mg的混合液致敏，第22天開始霧化吸入2%OVA30 min，5 d/周，持續(xù)4周。PBS組用磷酸鹽緩沖液替代，NAC組于每次霧化前1 h腹腔注射NAC （300 mg/kg，美國Sigma公司） 。

1.2 小鼠氣道反應(yīng)性檢測

末次霧化后24～48 h內(nèi)行氣道反應(yīng)性檢測 （法國EMKA無創(chuàng)肺功能儀） ，檢測小鼠在不同濃度的乙酰甲膽堿（分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL）霧化后增強呼氣間歇 （enhanced pause，Penh） 的水平，Penh較基線水平的倍數(shù)變化反映氣道高反應(yīng)程度。

1.3 小鼠肺泡灌洗液細胞計數(shù)

小鼠肺功能檢測后予戊巴比妥鈉 （2%，50 mg/kg，美國Sigma公司） 麻醉，氣道內(nèi)插入留置針，予生理鹽水0.5 mL注入氣道內(nèi)后回收，重復(fù)3次，回收量均＞80%。顯微鏡下計數(shù)細胞總數(shù)，4 ℃離心并重懸至合適濃度后甩片，行瑞氏-吉姆薩染色 （北京索萊寶科技有限公司，按說明書操作） ，每張涂片計數(shù)200個細胞進行細胞分類。

1.4 肺組織切片病理染色

左側(cè)肺組織取出后放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切片。肺組織切片 （5 μ m） 按照HE染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒、AB-PAS染色試劑盒 （北京索萊寶科技有限公司） 說明書進行染色。

1.5 免疫熒光檢測

切片脫蠟至水，檸檬酸鈉抗原修復(fù)1 min后，1%BSA封閉45 min，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 （microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3B） （武漢愛博泰克生物科技有限公司，1∶200） 4 ℃濕盒孵育過夜。洗后避光加入熒光二抗 （異硫氰酸熒光素，1∶100） 37 ℃ 30 min。清洗后加入DAPI染核 （20 μg/μL） 37 ℃ 30 min。甘油封片，圖像采集。

1.6 電鏡檢查自噬體

沿支氣管束走行方向剪下約0.3 cm×0.3 cm組織塊浸入2.5%戊二醛中固定，送入電鏡室行電鏡檢查。

1.7 LC3B蛋白電泳

BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，PVDF膜轉(zhuǎn)印，LC3B抗體4 ℃孵育過夜 （1∶1 000） ，二抗室溫1 h，ECL發(fā)光，UVP凝膠成像系統(tǒng) （美國Bio-Rad公司） 成像。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett’s T3法，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAC可減輕支氣管哮喘小鼠氣道炎癥

為了解NAC能否降低支氣管哮喘小鼠氣道炎癥，對肺組織行HE染色 （圖1） 和肺泡灌洗液細胞分類計數(shù) （表1） 。肺HE染色顯示，PBS組小鼠的支氣管氣道上皮細胞完整，氣道周圍沒有或僅有少量炎癥細胞浸潤；支氣管哮喘小鼠有顯著的炎癥細胞浸潤，上皮細胞層增厚，氣道管腔縮窄，平滑肌增厚；而NAC組顯示出良好的抑制氣道炎癥作用，氣道周圍僅有輕度炎癥細胞浸潤，氣道上皮細胞結(jié)構(gòu)完整，管腔狹窄較OVA組亦明顯好轉(zhuǎn)。

小鼠肺泡灌洗液結(jié)果也顯示，NAC具有抑制氣道炎癥的作用。NAC組小鼠肺泡灌洗液較OVA組小鼠細胞總數(shù)明顯下降，其中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞及中性粒細胞下降明顯，有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0.001） 。

2.2 NAC抑制支氣管哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性（表2）

隨著乙酰甲膽堿濃度逐步上升，各組小鼠的Penh均呈上升趨勢，OVA組小鼠氣道反應(yīng)性升高最為明顯，乙酰甲膽堿濃度為6.25 mg/mL時即顯著升高 （P＜ 0.05） 。NAC組自12.5 mg/mL濃度后較OVA組明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜ 0.05） ，自25 mg/mL濃度后才較PBS組升高，有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜ 0.05） 。

2.3 NAC抑制氣道上皮細胞黏液分泌及膠原蛋白沉積

OVA組小鼠氣道AB-PAS染色顯示，大多數(shù)氣道上皮細胞均呈強陽性改變，而NAC組PAS陽性細胞數(shù)顯著下降。氣道上皮下膠原蛋白沉積是支氣管哮喘氣道重塑的重要病理生理學(xué)改變。Masson染色可見，OVA組較PBS組氣道上皮及血管周圍大量的膠原蛋白沉積，上皮層明顯增厚，而NAC組上皮下膠原沉積減少。

表1 各組小鼠肺泡灌洗細胞分類計數(shù) （×105/mL）Tab.1 Cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in each group （×105/mL）

圖1 各組小鼠肺組織切片染色 ×200Fig.1 Histochemical staining of lung tissue sections in each group ×200

2.4 NAC抑制肺組織氣道上皮細胞的自噬水平

LC3B免疫熒光顯示，PBS組的氣道上皮細胞的細胞質(zhì)中僅有極少量細胞陽性表達，OVA組的氣道上皮細胞的細胞質(zhì)中LC3B高表達，幾乎所有的上皮細胞均發(fā)生自噬反應(yīng)，而NAC組中LC3B的表達減弱，表達LC3B的上皮細胞數(shù)目減少 （圖2） 。透射電鏡結(jié)果亦顯示，OVA組小鼠部分氣道上皮細胞中出現(xiàn)很多自噬體。NAC可見少量自噬體（圖3） 。蛋白電泳結(jié)果 （圖4） 同樣顯示，OVA組LC3BⅡ型明顯增多，NAC組LC3BⅡ型減少。

3 討論

氣道上皮細胞是肺組織的第1道屏障，其屏障功能除物理屏障功能外還發(fā)揮著化學(xué)屏障及免疫屏障的功能［2，5］。越來越多的研究［6-9］表明，氣道上皮細胞在支氣管哮喘發(fā)病及氣道重塑過程中發(fā)揮著不容忽視的作用。氣道上皮細胞通過分泌MUC5AC黏蛋白、促纖維化生長因子自噬與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等參與氣道重塑。

本研究結(jié)果顯示，NAC具有良好的抗氣道炎癥及氣道重塑的作用，這與既往研究NAC對哮喘小鼠的作用結(jié)果相一致［10］。然而既往的研究均關(guān)注于NAC對氣道的抗氧化抗炎作用，本研究著重關(guān)注于NAC對氣道上皮細胞自噬水平的影響。本研究表明，NAC組小鼠肺泡灌洗液中不僅嗜酸性粒細胞數(shù)減少，中性粒細胞數(shù)亦明顯減少，說明NAC在緩解氣道炎癥的基礎(chǔ)上針對難治性哮喘可能有進一步的治療作用，亦有文獻［11］支持NAC可抑制激素耐受型支氣管哮喘的急性發(fā)作。近期許多研究［12-13］均表明，自噬是導(dǎo)致支氣管哮喘氣道上皮細胞發(fā)生杯狀細胞轉(zhuǎn)化及MUC5AC分泌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，自噬同樣是導(dǎo)致氣道上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一［14］。過度的自噬可能是氣道上皮細胞功能障礙的原因。本研究結(jié)果顯示，NAC可減輕氣道上皮細胞的黏液分泌，抑制支氣管哮喘氣道上皮細胞的過度自噬。由此可推測NAC可能通過抑制氣道上皮細胞的過度自噬從而保護氣道上皮細胞，減少膠原沉積及黏液分泌，進而緩解氣道重塑。

表2 不同濃度的乙酰甲膽堿霧化后各組小鼠的Penh值Tab.2 Enhanced pause values in different mouse groups after acetylcholine treatment

圖2 肺組織LC3B免疫熒光染色 ×200Fig.2 Immunohistochemical staining of microtubule-associated proteins 1A/1B light chains 3B in lung tissues ×200

圖3 氣道上皮細胞透射電鏡檢查Fig.3 Transmission electron microscopy examination of airway epithelial cells

圖4 Western blotting分析各組小鼠肺組織LC3B表達Fig.4 LC3B expression by Western blotting analysis in mice lung tissues in each group

本研究通過動物模型的方法驗證NAC對哮喘小鼠氣道上皮細胞自噬水平的作用具有局限性，需進一步完善細胞實驗，明確NAC針對氣道上皮細胞自噬水平的作用機制及作用靶點。值得注意的是，NAC對支氣管哮喘的是否真的有效目前尚沒有確切證據(jù)，相關(guān)的臨床試驗表明，NAC在抑制哮喘患者的急性發(fā)作的研究中未見明確療效，但該研究僅有50例患者入選，NAC也僅應(yīng)用5 d［15］。是否可以長期應(yīng)用NAC輔助控制氣道上皮細胞的自噬水平，從而達到減輕氣道重塑效果尚不清楚，本研究通過動物實驗表明，NAC對氣道上皮細胞自噬功能的影響有可能成為治療支氣管哮喘新的突破口。

綜上所述，NAC可減輕支氣管哮喘的氣道炎癥及氣道重塑，氣道上皮細胞自噬水平的降低可能在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，有望成為治療哮喘，緩解氣道重塑的新方向，但其具體機制仍有待進一步研究。

［1］ TSICOPOULOS A，DE NADAI P，GLINEUR C. Environmental and genetic contribution in airway epithelial barrier in asthma pathogenesis［ J］. Curr Opin Allergy Clin Immunol，2013，13（ 5） ：495-499.DOI：10.1097/ACI.0b013e328364e9fe.

［2］ GEORAS SN，REZAEE F . Epithelial barrier function：at the frontline of asthma immunology and allergic airway inflammation［ J］. J Allergy Clin Immunol，2014，134（ 3） ：509-520. DOI：10.1016/j.jaci.2014.05.049.

［3］ POON A，EIDELMAN D，LAPRISE C，et al. ATG5，autophagy and lung function in asthma.［ J］. Autophagy，2012，8（ 4） ：694-695. DOI：10.4161/auto.19315.

［4］ POON AH，CHOUIALI F，TSE SM，et al. Genetic and histological evidence for autophagy in asthma pathogenesis［ J］. J Allergy Clin Immunol，2012，129（ 2） ：569-571. DOI：10.1016/j.jaci.2011.09.035.

［5］ LOXHAM M，DAVIES DE，BLUME C. Epithelial function and dysfunction in asthma［ J］. Clin Exp Allergy，2014，44（ 11） ：1299-1313.DOI：10.1111/cea.12309.

［6］ SHIMIZU S，KOUZAKI H，OGAWA T，et al. Eosinophil-epithelial cell interactions stimulate the production of MUC5AC mucin and profibrotic cytokines involved in airway tissue remodeling［ J］. Am J Rhinol Allergy，2014，28（ 2） ：103-109. DOI：10.2500/ajra.2014.28.4018.

［7］ HACKETT TL. Epithelial-mesenchymal transition in the pathophysiology of airway remodeling in asthma［ J］. Curr Opin Allergy Clin Immunol，2012，12（ 1） ：53-59. DOI：10.1097/ACI.0b013e32834ec6eb.

［8］ ROYCE SG，LI X，TORTORELLA S，et al. Mechanistic insights into the contribution of epithelial damage to airway remodeling. Novel therapeutic targets for asthma［ J］. Am J Respir Cell Mol Biol，2014，50（ 1） ：180-192. DOI：10.1165/rcmb.2013-0008OC.

［9］ PROUD D，LEIGH R. Epithelial cells and airway diseases［ J］.Immunol Rev，2011，242（ 1） ：186-204. DOI：10.1111/j.1600-065X.2011.01033.x.

［10］ BLESA S，CORTIJO J，MARTINEZ-LOSA M，et al. Effectiveness of oral N -acetylcysteine in a rat experimental model of asthma［ J］. Pharmacol Res，2002，45（ 2） ：135-140. DOI：10.1006/phrs.2001.0917.

［11］ EFTEKHARI P，HAJIZADEH S，RAOUFY MR，et al. Preventive effect of N-acetylcysteine in a mouse model of steroid resistant acute exacerbation of asthma［ J］. EXCLI J，2013，12：184-192.

［12］ DICKINSON JD，ALEVY Y，MALVIN NP，et al. IL13 activates autophagy to regulate secretion in airway epithelial cells［ J］. Autophagy，2016，12（ 2） ：397-409. DOI：10.1080/15548627.2015.1056967.

［13］ ZHOU JS，ZHAO Y，ZHOU HB，et al. Autophagy plays an essential role in cigarette smoke-induced expression of MUC5AC in airway epithelium［ J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2016，310（ 11） ：L1042-1052. DOI：10.1152/ajplung.00418.2015.

［14］ LIU T，LIU Y，MILLER M，et al. Autophagy plays a role in FSTL1-induced epithelial mesenchymal transition and airway remodeling in asthma［ J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2017，313（ 1） ：L27-L40. DOI：10.1152/ajplung.00510.2016.

［15］ ALIYALI M，POORHASAN AMIRI A，SHARIFPOOR A，et al. Effects of N-acetylcysteine on asthma exacerbation［ J］. Iran J Allergy Asthma Immunol，2010，9（ 2） ：103-109. DOI：09.02/ijaai.103109.