趙芳英，高秀秋，劉姊鳳

（錦州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院牙體牙髓科，遼寧 錦州 121000）

骨髓間充質(zhì)干細胞 （bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs） 是具有多種分化潛能的細胞，在成人的骨骼中，BMMSCs主要向成骨細胞和脂肪細胞分化，兩者的比例對調(diào)控骨組織重建與代謝有重要作用［1］。Wnt信號通路在牙發(fā)育和骨形成過程中作用顯著［2-3］。活化的經(jīng)典Wnt通路通過上調(diào)成骨分化相關(guān)基因Runx2、Dlx5、Osterix和ALP促進BMMSCs向成骨分化［4］?？梢奧nt信號通路與許多骨疾病密切相關(guān)，并參與BMMSCs分化方向的調(diào)控，但在Wnt信號通路中關(guān)鍵基因調(diào)控BMMSCs的分化方向及變化趨勢尚未見文獻報道。因此本研究探究Wnt3a蛋白對BMMSCs不同時間點成骨分化的影響，以及與Wnt/β-catenin 信號通路調(diào)控的關(guān)系，以期為Wnt3a誘導的BMMSCs在骨修復中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

BMMSCs購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；DMEM/F12購自美國Hyclone公司；胎牛血清FBS購自美國SerePro公司；BMMSCs成骨誘導液購自美國Cyagen公司；細胞RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；引物由大連寶生物有限公司合成；Wnt3a蛋白購自美國Absci公司。

1.2 實驗分組

實驗分為誘導對照組和Wnt3a蛋白誘導組，誘導對照組：成骨誘導培養(yǎng)基 （地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、10%FBS、1%雙抗） ，Wnt3a蛋白誘導組：成骨誘導培養(yǎng)基 （地塞米松、β甘油磷酸鈉、維生素C、10%FBS、1%雙抗） 和10 ng/mL Wnt3a蛋白。2組分別在誘導后的第1、5、10、15和20天于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、染色、RNA提取及蛋白提取。

1.3 BMMSCs成骨誘導培養(yǎng)

將凍存的BMMSCs從液氮罐中取出，置于37 ℃水浴鍋內(nèi)，搖動使其融化。將細胞懸液移入加有適量培養(yǎng)液的離心管中離心，棄上清后加入含地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、10%FBS、1%雙抗和10 ng/mLWnt3a蛋白的成骨培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。每2～3 d換液1次，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，待細胞密度達70%～80%時進行傳代培養(yǎng)。

1.4 茜素紅染色

選擇生長狀態(tài)良好的BMMSCs，用0.05%胰蛋白酶消化，接種于6孔板中，加入上述已配好的成骨誘導培養(yǎng)基，于誘導第1、5、10、15和20天顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長變化情況，應用10%中性甲醛固定30 min后，PBS沖洗，加入茜素紅染液染色。顯微鏡下觀察成骨染色效果。

1.5 實時PCR檢測RUNX2、 β-catenin及BSP mRNA

提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作按照產(chǎn)品說明書進行。實時PCR反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；55 ℃ 30 s 80個循環(huán)，繪制熔解曲線。RUNX2引物序列為F 5’-AGGGGCTGTGG AGTTTGGT-3’， R 5’-TGACTTTTCGGGGAGGAGA G-3’；β-catenin引物序列為F 5’-GCCAG TGGATTCC GTACTG-3’，R 5’-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG- 3’；BSP引物序列為F 5’-GCGTGCTTCTTAGACGGACT G-3’，R 5’-CGTCAGAGGGCTGGGATG-3’；GAPDH引 物 序 列 為F 5’-TGCACCACCAACTGCTTAG-3，R 5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3。采 用 2-ΔΔCT法 計算目的基因相對表達量。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達

用蛋白裂解液提取細胞蛋白，BCA法做蛋白定量，取已制備樣品10 μ L進行 SDS-PAGE電泳。120 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加1∶1 000 Runx2/ 1∶1 000 β-catenin/1∶1 000 BSP/1∶5 000 actin一抗，4 ℃過夜。加1∶10 000 HRP IgG二抗，室溫孵育1 h。ECL顯影，用Scion Image 4. 03 軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件One-Way ANOVA分析實驗數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果以±s表示，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)

光學顯微鏡下觀察BMMSCs不同生長階段形態(tài)學，Wnt3a蛋白誘導組第1天可見細胞呈小圓形、散在分布，隨著時間的延長細胞分化明顯，至第10天細胞呈紡錘形，偶呈扁平狀和多角形，有小集落形成，呈不規(guī)則短梭，至第20天細胞形態(tài)基本一致，排列較整齊，呈長梭形成纖維樣，漩渦狀生長，見圖1。誘導對照組細胞較Wnt3a蛋白誘導組，在各個時間點分化程度明顯減弱。

2.2 茜素紅染色

茜素紅染色鏡下顯示，BMMSCs向成骨誘導分化的過程，部分細胞逐漸聚集一起呈“集落狀”生長，形成礦化結(jié)節(jié)，在誘導第5天后茜素紅染色可見密集的散在的橘紅色礦化結(jié)節(jié)。與誘導對照組相比，Wnt3a蛋白誘導組各時間點可見較多的橘紅色礦化結(jié)節(jié)。見圖2。

2.3 RUNX2、β-catenin及BSP mRNA表達水平

研究結(jié)果表明，誘導對照組和Wnt3a蛋白誘導組BMMSCs成骨過程中，RUNX2、β-catenin及BSPmRNA有不同水平的增加，均在第10天達到峰值。Wnt3a蛋白誘導組RUNX2、β-catenin及BSPmRNA表達水平在各個時間點均明顯高于誘導對照組 （P＜0.05） 。誘導對照組RUNX2、β-catenin及BSPmRNA表達在誘導后第1、5、10天有明顯上升趨勢 （P＜ 0.05） ，隨后在第15、20天呈下降趨勢，但下降幅度無統(tǒng)計學意義 （P＞ 0.05） 。見圖3。

2.4 RUNX2、β-catenin及BSP蛋白表達情況

圖1 BMMSCs形態(tài) ×100Fig.1 Morphology of human bone marrow mesenchymal stem cells ×100

圖2 茜素紅染色 ×100Fig.2 Alizarin red staining × 100

誘導對照組和Wnt3a蛋白誘導組BMMSCs成骨過程中，RUNX2、β-catenin及BSP蛋白表達有不同水平的增加，均在第10天達到峰值。Wnt3a蛋白誘導組RUNX2、β-catenin蛋白表達水平在誘導后的第5、10、15和20天明顯高于誘導對照組 （P＜ 0.05） ，BSP蛋白表達在各個時間點均明顯高于誘導對照組 （P＜0.05） 。誘導對照組RUNX2、β-catenin及BSP表達在誘導后第1、5、10天有明顯上升趨勢 （P＜ 0.05） ，隨后小幅下降 （P＞ 0.05） 。見圖4、5。

3 討論

BMMSCs具有自我克隆增殖，并能向成脂細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞等分化的能力，體外通過不同的誘導方法使BMMSCs分化成軟骨、成骨細胞等用于多種疾病的治療，被稱為“種子細胞”［5］。Wnt信號通路是近年來研究細胞生物學行為的新熱點，激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號能夠促進干細胞骨向分化、自我更新及抑制凋亡等機制增加骨組織的再生［6］。但是，BOLAND 等［7］報道Wnt/β-catenin信號通路中一些蛋白信號的過度增強反而會誘導BMMSCs衰老。Wnt3a是Wnt蛋白家族一員，主要通過旁分泌、自分泌方式釋放于胞外，并結(jié)合細胞表面受體，激活下游信號產(chǎn)生級聯(lián)效應［8-9］。本研究采用小劑量Wnt3a蛋白對BMMSCs進行干預，觀察Wnt3a在不同分化時間點對BMMSCs成骨分化的調(diào)控作用，探索經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通道對于BMMSCs成骨分化的調(diào)節(jié)機制。

圖3 RUNX2、β-catenin及BSP mRNA相對表達量Fig.3 Relative mRNA expression of RUNX2，β-catenin，and BSP

圖4 RUNX2、β-catenin及BSP的蛋白表達Fig.4 Expression of RUNX2，β-catenin and BSP

圖5 RUNX2、β-catenin及BSP蛋白相對表達量Fig.5 Relative expression of RUNX2，β-catenin and BSP

本研究中，茜素紅染色結(jié)果顯示，BMMSCs在體外培養(yǎng)的環(huán)境下，進入干細胞定向期，啟動向成骨細胞的分化。通過成骨誘導液 （地塞米松、維生素C、β-磷酸甘油鈉） 聯(lián)合Wnt3a蛋白，誘導干細胞進入細胞外基質(zhì)沉積期。本研究誘導5 d后，Wnt3a蛋白誘導組與誘導正常組比較，前者向成骨細胞誘導分化的干細胞中Wnt信號通路關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導因子β-catenin和成骨相關(guān)蛋白RUNX2、BSP表達明顯升高，表達高峰出現(xiàn)在第10天，之后有輕度下降趨勢。提示W(wǎng)nt3a蛋白通過活化Wnt信號通路進而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導因子和成骨相關(guān)蛋白水平。周大凱等［10］研究發(fā)現(xiàn)，高表達RUNX2可上調(diào)成骨相關(guān)基因、BMP-2、OCN、ALP基因和蛋白的表達水平，進而促進臍血間充質(zhì)干細胞成骨分化。涂艷等［11］發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以提高β-catenin和RUNX2的蛋白表達水平，激活Wnt/β-catenin信號通路，參與并調(diào)控BMMSC的成骨分化。本研究結(jié)果顯示，Wnt3a可能通過Wnt/β-catenin信號途徑促進BMMSCs成骨分化，且在成骨誘導的早期刺激效果最佳，在成骨誘導的后期，Wnt3a蛋白對成骨誘導效果減弱。這說明經(jīng)典Wnt信號通路對骨分化的調(diào)節(jié)作用依細胞分化程度的不同而不同。一旦BMMSCs啟動向成骨分化的方向，Wnt 信號通路促進干細胞向成骨分化，即細胞形態(tài)由梭形轉(zhuǎn)變成多角形；RUNX2、BSP等成骨特定基因高表達；ALP特異性蛋白的表達；礦化結(jié)節(jié)的出現(xiàn)。而CHO等［13］和DE BOER等［14］報道高水平Wnt3a 表達能減緩正在發(fā)生骨生成BMMSCs的基質(zhì)鈣化進程和降低 ALP 活性，抑制地塞米松誘導BMMSCs的成骨發(fā)生。可見Wnt3a對BMMSCs成骨分化的調(diào)控作用與Wnt3a劑量有直接關(guān)系。

綜上所述，BMMSCs的體外成骨受Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控，并受細胞分化階段的影響，在BMMSCs進入分化階段后，Wnt3a所介導的Wnt信號通路促進BMMSCs向成骨分化，但在成骨細胞發(fā)育晚期，Wnt3a介導的Wnt信號通路對BMMSCs作用由促進變?yōu)橐种瞥晒羌毎?，最終發(fā)育成熟。

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