陳安徽，范 旺，張良睿,邵 穎

(1.徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇徐州 221111;2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，徐州工程學院，江蘇徐州 221111)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又名北冬蟲夏草、北蟲草，是蟲草屬的模式種菌，屬子囊菌亞門蟲草屬，食用價值較高。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草和冬蟲夏草的藥用價值及保健價值較相近[1]。近年來的大量研究也表明，蟲草多糖是蛹蟲草中含量最多且藥理活性豐富的物質(zhì)。蛹蟲草多糖具有耐熱、鹽，調(diào)節(jié)pH的作用[2-3]，除此之外還有如降血糖、抗腫瘤、抗菌活性、抗氧化活性、增強單核巨噬細胞系統(tǒng)的功能，強化巨噬細胞吞噬能力[4-5]，治療肝病毒性感染等[6-7]，提高自然殺傷(NK)細胞活性[8]，對機體過度疲勞、肝臟修復等有生物活性[9]，蛹蟲草多糖的開發(fā)應用前景廣闊。

傳統(tǒng)的多糖提取方法主要包括酶提取法[10]、堿浸提法[11]、熱水浸提法[12]、稀酸浸提法[13]、超聲波輔助提取法[14]和微波輔助提取法[15]等，在這些方法中熱水浸提法是最為常用的提取方法。熱水浸提法工藝簡單、成本低廉、易于推廣，且對多糖的破壞性較小。筆者通過比較熱水浸提法與超聲波水提法對蛹蟲草子實體多糖提取的影響確定多糖的提取方法，并對蛹蟲草多糖熱水浸提法的提取工藝進行了優(yōu)化，為蛹蟲草多糖的進一步分離純化、活性研究及開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品。蛹蟲草，江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室發(fā)酵工程實驗室自行栽培。

1.1.2儀器設(shè)備與試劑。儀器設(shè)備：TUMEN TL-15高速離心機，吉林圖們離心機廠；梅特勒AE200型電子天平，上海分析儀器廠；SENCO R-502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)公司；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(HH-4)，國華電器有限公司；真空冷凍干燥機(LGJ-10)，上海比朗儀器有限公司；超低溫冰箱(MDF594)，日本SANYO電子有限公司。

試劑：DPPH，美國sigma公司；葡萄糖，上海源葉生物科技有限公司；菲啰嗪(Ferrozine)，上海市源葉生物科技有限公司；鐵氰化鉀，上海生工生物試劑有限公司；乙二胺四乙酸鈉，天津市鼎盛鑫化工有限公司；95%乙醇、無水乙醇，徐州師范大學科技開發(fā)總公司化工廠；苯酚、濃硫酸、三氯甲烷，無錫市亞盛化工有限公司。

1.2方法

1.2.1葡萄糖標準曲線的制作。準確稱取標準葡萄糖100 mg于500 mL容量瓶中，配制成200 mg/mL的葡萄糖溶液，然后用蒸餾水稀釋成 0、20、40、60、80、100、120、140 mg/mL的梯度濃度溶液。分別取不同梯度濃度的葡萄糖溶液1 mL于試管中，先加入6%苯酚溶液1 mL，然后迅速加入濃硫酸5 mL，靜置10 min后搖勻并于室溫再靜置20 min后測定波長490 nm處的吸光值，以葡萄糖溶液濃度(x)為橫坐標，吸光值(y)為縱坐標制作葡萄糖標準曲線。標準曲線如圖1所示。標準曲線回歸方程為y=0.005 5x-0.005 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

1.2.2蛹蟲草多糖提取方式的選擇。

1.2.2.1熱水浸提法。準確稱取1 g蛹蟲草粉，以料液比為1∶20(g/mL)的比例加入蒸餾水并于90 ℃水浴鍋中浸提2 h，4 000 r/min條件下離心 5 min，取上清液測定多糖含量。

1.2.2.2超聲波水提法。準確稱取1 g蛹蟲草粉，以料液比為1∶20 (g/mL)的比例加入蒸餾水于70 ℃超聲浸提30 min，重復3次，4 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液并測定多糖含量。

1.2.3多糖含量的測定。準確吸取1.0 mL蛹蟲草多糖提取液于試管中，先加入6%苯酚溶液1 mL，然后迅速加入濃硫酸5 mL，靜置10 min后搖勻并于室溫再靜置20 min后測定波長490 nm處的吸光值，并帶入標準曲線的回歸方程，按照下式計算多糖提取率。

多糖提取率=(C×稀釋倍數(shù)×V)/m×100%

式中，C為測定樣品液的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為提取液體積(mL)；m為蛹蟲草粉的質(zhì)量(mg)。

1.2.4蛹蟲草多糖提取工藝的優(yōu)化。

1.2.4.1料液比的選擇。準確稱取1 g蛹蟲草粉末5份，分別按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)的比例加入蒸餾水于90 ℃條件下浸提2 h，4 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液并測定多糖含量，確定最優(yōu)料液比。

1.2.4.2浸提溫度的選擇。準確稱取1 g蛹蟲草粉末5份，按照1∶30(g/mL)的比例加入蒸餾水分別于60、70、80、90、100 ℃條件下浸提2 h，4 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液并測定多糖含量，確定最優(yōu)浸提溫度。

1.2.4.3浸提時間的選擇。準確稱取1 g蛹蟲草粉末4份，按照1∶30(g/mL)的比例加入蒸餾水分別于90 ℃條件下浸提1、2、3、4 h，浸提后于4 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液并測定多糖含量，確定最優(yōu)浸提時間。

1.2.4.4蛹蟲草多糖提取正交試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計L9(34)正交試驗方案以確定最佳熱水浸提提取工藝。因素水平設(shè)計見表1。

1.2.5蛹蟲草多糖的抗氧化活性。

表1 正交試驗設(shè)計方案

1.2.5.1蛹蟲草多糖溶液的制備。稱取10 g蛹蟲草以料液比為1∶20(g/mL)的比例加入蒸餾水并于80 ℃水浴鍋中浸提1.5 h，4 000 r/min條件下離心5 min后過濾收集上清液，上清液使用乙醇于4 ℃條件下醇沉，離心后收集沉淀。所得沉淀用75%的乙醇重復洗滌2次后再用60 ℃的蒸餾水溶解，冷凍干燥備用。

將冷凍干燥后的蛹蟲草多糖溶解于蒸餾水中，并將其稀釋至0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL質(zhì)量濃度的樣品溶液，以測定DPPH自由基清除活性。

將蛹蟲草多糖溶液稀釋成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mg/mL質(zhì)量濃度的樣品溶液，以測定鐵離子螯合能力。

1.2.5.2DPPH自由基清除活性。參考邵穎等[16]的方法進行測定。

1.2.5.3鐵離子螯合能力。參考鄭義等[17]的方法進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1蛹蟲草多糖提取方法的確定采用熱水浸提和超聲波水提法對蛹蟲草子實體多糖進行浸提并測定多糖的提取率以評價2種提取方法的提取效果。結(jié)果得出，熱水浸提法提取率為(7.83±0.92)%，超聲波水提法提取率為(5.64±1.07)%，2種方法在95%置信度下有一定的顯著水平。

由該試驗結(jié)果可知，熱水浸提法更有利于蛹蟲草子多糖的提取，提取率達到(7.83±0.92)%，顯著高于超聲波水提法(P<0.05)。

2.2熱水浸提法提取工藝的優(yōu)化

2.2.1單因素試驗。

2.2.1.1料液比對蛹蟲草多糖得率的影響。圖2的結(jié)果顯示，當提取料液比為1∶20(g/mL)時，蛹蟲草多糖的提取率達到(7.94±0.36)%，顯著高于料液比為1∶10(g/mL)時的提取率(P<0.05)。隨后再增加蒸餾水浸提蛹蟲草多糖的提取率也未有顯著增加。所以，該試驗條件下選擇蛹蟲草提取的最優(yōu)料液比為1∶20(g/mL)。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著Note:Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level圖2 料液比對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides from Cordyceps militaris

2.2.1.2浸提溫度對蛹蟲草多糖得率的影響。從圖3可以看出，當浸提溫度在60～90 ℃時，多糖提取率隨著浸提溫度的提高而不斷增加。當浸提溫度為90 ℃時，蛹蟲草多糖的提取率達到8.22%，浸提溫度為100 ℃時，多糖得率為8.24%，但2種浸提溫度對蛹蟲草多糖的提取率間不存在顯著性差異，但與其他浸提溫度間差異顯著(P<0.05)。因此，從浸提成本角度考慮，該試驗選擇90 ℃為最佳浸提溫度進行后續(xù)試驗。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著Note:Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level圖3 浸提溫度對蛹蟲草多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides from Cordyceps militaris

2.2.1.3浸提時間對蛹蟲草多糖得率的影響。由圖4可知，多糖得率隨著浸提時間的增加而增加。提取時間為1 h時，多糖的得率為7.16%，提取時間為2 h，多糖得率為8.18%，顯著高于浸提時間為1 h時的提取率(P<0.05)。但當浸提時間超過2 h，蛹蟲草多糖的提取率未有顯著增加。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著Note:Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level圖4 浸提時間對蛹蟲草多糖提取的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides from Cordyceps militaris

2.2.2正交試驗結(jié)果。在單因素試驗的基礎(chǔ)上對熱水浸提法進行正交試驗以優(yōu)化蛹蟲草多糖的最佳提取工藝。正交試驗結(jié)果如表2所示。

由表2可知，影響熱水浸提法提取結(jié)果的主次因素為B>A>C，即浸提溫度>料液比>浸提時間；最優(yōu)條件組合為B1A2C1，即浸提溫度80 ℃、料液比1∶20(g/mL)、浸提時間1.5 h，在此條件下進行驗證試驗，蛹蟲草多糖得率為9.31%，提取率高于正交試驗結(jié)果。

2.3蛹蟲草多糖的抗氧化活性

2.3.1DPPH自由基清除活性。蛹蟲草多糖的DPPH自由基清除活性如圖5所示。

表2 正交試驗結(jié)果

由圖5可知，蛹蟲草多糖對DPPH自由基具有明顯的清除活性。在一定的濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除活性隨著多糖濃度的提高而增強。當多糖濃度在1.2 mg/mL，DPPH清除率為29.45%；多糖濃度在2.00 mg/mL時，DPPH清除率為37.56%；而當多糖濃度在10.00 mg/mL時，清除率僅為39.6%。由圖5也看出，當多糖濃度為4.00 mg/mL,清除DPPH能力趨于平緩，清除率保持在38.69%。

圖5 蛹蟲草多糖對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of Cordyceps militaris polysaccharide on DPPH radical scavenging rate

2.3.2鐵離子螯合能力。按照“1.2.5.3”的方法，考察蛹蟲草多糖對鐵離子的螯合能力，結(jié)果如圖6所示。

圖6 蛹蟲草多糖對鐵離子的螯合作用Fig.6 Chelation of polysaccharide from Cordyceps militaris on iron ions

從圖6可以看出，蛹蟲草多糖在0.5～4.5 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，鐵離子的螯合能力低于VC，且隨著樣品濃度的增大而增大。當多糖濃度為2.0 mg/mL，鐵離子螯合率為34.24%；多糖濃度為3.5 mg/mL，螯合率為56.66%，經(jīng)數(shù)據(jù)分析，螯合率顯著增加。而當多糖濃度達到4.5 mg/mL時，螯合率僅為57.89%，增加不顯著；當多糖濃度為4.0 mg/mL,鐵離子螯合能力增加趨于平緩，螯合率保持在57.32%。說明蛹蟲草多糖具有較好的鐵離子螯合能力，但低于VC對鐵離子的螯合效果。

3 結(jié)論

通過比較熱水浸提法和超聲波水提法對蛹蟲草多糖的提取效果，發(fā)現(xiàn)熱水浸提法顯著優(yōu)于超聲波水提法。采用正交試驗法優(yōu)化了熱水浸提法提取工藝，其最佳提取條件為料液比為1∶20(g/mL)，溫度80 ℃，浸提時間1.5 h，在該提取條件下，蛹蟲草多糖的提取率為9.31%。蛹蟲草多糖在特定的濃度范圍內(nèi)，對DPPH自由基清除和鐵離子螯合能力隨著多糖濃度的提高而增加。當蛹蟲草多糖質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到38.69%；而當多糖濃度為3.5 mg/mL時對鐵離子的螯合率達到了56.66%，之后雖活性略有增加但效果不顯著。由此可知，蛹蟲草多糖具有一定的抗氧化活性。

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