于晏瓔，周賢軒

(合肥工業(yè)大學食品科學與工程學院，安徽合肥 230009)

噬菌體P1是一種溶源噬菌體，可以侵染大腸桿菌和一些其他的革蘭氏陰性菌。噬菌體P1之所以引起研究者興趣，是因為它可以捕捉宿主的基因組DNA包裝在蛋白質(zhì)衣殼里面作為自己的基因，從而產(chǎn)生新一代的噬菌體。新的噬菌體在侵染其他的細菌后，可將捕捉到的DNA整合到新宿主的基因組上[1]，這一過程被稱為轉(zhuǎn)導。目前，P1作為轉(zhuǎn)導工具被廣泛應(yīng)用于基因工程中。P1屬于肌病毒科，基因組約有93 kb，被包圍在一個二十面體的頭部里面[2-3]。在病毒粒子中，它以線性雙鏈DNA分子的形式存在。它的尾部是由6個尾纖維組成的收縮尾[4-5]。在侵染細菌時，噬菌體顆粒利用尾部纖維吸附在細菌表面，并與細菌表面的受體特異性結(jié)合。接下來，尾鞘收縮，將線性DNA注入宿主細胞。在DNA被注入后，宿主DNA重組機制或病毒DNA表達重組酶，將末端冗余序列重組，以環(huán)化噬菌體基因組。P1可能會進入溶源狀態(tài)，也可能會立即進入裂解階段[5]。

P1是在革蘭氏陰性菌中被普遍應(yīng)用的轉(zhuǎn)導工具。P1能夠包裝供體菌的基因組DNA形成子代的噬菌體。由于噬菌體基因組的高突變性，導致部分的子代噬菌體成為缺陷噬菌體，在侵染受體菌時，不能裂解宿主細胞，而是通過同源重組的方式整合到宿主基因組上。雖然P1作為轉(zhuǎn)導工具具有方便、快速、高效等優(yōu)點，但是它的使用范圍有諸多限制：①對于一些細胞表面覆蓋莢膜多糖的細菌，P1不能侵染[6]；②對于一些細胞表面表達O抗原的細菌，P1也不能侵染；③P1的侵染位點被認為位于細胞表面的脂多糖(LPS)的核心上，但是具體是位于哪一位的糖基上，至今還未被發(fā)現(xiàn)。

筆者以大腸桿菌Nissle 1917(EcN)為試驗菌株。EcN血清型為O6∶K5∶H1，其表達K5莢膜多糖，覆蓋在細胞表面[7]。此外，EcN還表達O6抗原。該研究通過λ-RED系統(tǒng)[8]突變其K抗原合成基因來檢測K抗原是否影響P1侵染EcN，并逐個突變LPS合成基因，通過檢測轉(zhuǎn)導效率的方式來確定P1的侵染位點。

1 材料與方法

1.1材料試驗所用試劑均購于生工生物工程(上海)股份有限公司；引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。大腸桿菌培養(yǎng)所需的抗生素為氨芐青霉素(100 μg/mL)、卡那霉素(50 μg/mL)和氯霉素(25 μg/mL)。噬菌體P1由筆者所在實驗室保存。

1.2方法

1.2.1基因敲除。采用λ-RED同源重組系統(tǒng)對EcN進行基因敲除。首先，利用帶有待敲除基因兩端的39 bp同源臂的引物對，以質(zhì)粒pKD4/pKD3為模板，PCR擴增帶有FRT位點的抗性片段。接下來，將該PCR產(chǎn)物純化，并電擊轉(zhuǎn)化至EcN/pKD46電擊感受態(tài)細胞中，涂布于相應(yīng)的抗性平板，30 ℃隔夜培養(yǎng)。抗性平板上篩選出的單克隆菌株用菌落PCR進行驗證，以選擇出陽性克隆。

1.2.2P1裂解液制備。P1裂解液在大腸桿菌ZK126中制備。首先將隔夜活化的菌液以1%的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的3 mL LB培養(yǎng)基中，同時添加10 mmol/L MgCl2、5 mmol/L CaCl2和0.1%葡糖糖，置于37 ℃、220 r/min的搖床中，培養(yǎng)至對數(shù)中期。接下來向供體菌中加入100 μL噬菌體P1，37 ℃培養(yǎng)3 h，直至培養(yǎng)基中有細胞殘渣出現(xiàn)，且菌液濃度不再升高后，向裂解液中加入100 μL氯仿，振蕩混勻10 min，12 000 r/min離心2 min，去除細胞碎片，把上清吸出，存于-4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3噬菌體P1轉(zhuǎn)導。首先，用噬菌體P1侵染受體菌，制備包裝有受體菌ZK126ΔrecA：：Kan基因組DNA的裂解液。該方法與制備P1裂解液步驟相同。其次，收集2 mL受體菌隔夜培養(yǎng)的菌液，13 000 r/min離心2 min，收集菌體，并加入1 mL 含有10 mmol/L MgSO4、5 mmol/L CaCl2的LB培養(yǎng)基，重懸細胞。接下來，將包裝了ZK126ΔrecA：：Kan 基因組DNA的噬菌體P1與受體菌混合，37 ℃靜止培養(yǎng)30 min后，加入200 μL 1 mol/L的檸檬酸鈉和1 mL無抗LB培養(yǎng)基，置37 ℃、200 r/min的搖床中復蘇1 h。復蘇后，6 000 r/min離心5 min，收集菌體，加入100 μL含有0.01 mol/L檸檬酸鈉的LB液體培養(yǎng)基重懸細胞，涂布到卡那霉素抗性平板上，過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)的單克隆由菌落PCR檢測以選擇出陽性克隆。被選擇的陽性克隆轉(zhuǎn)接到含10 mmol/L檸檬酸鈉的50 μg/mL卡那霉素抗性平板上劃線傳代2次后，可保存菌種。

1.2.41H NMR樣品制備。首先，將隔夜培養(yǎng)的活化菌液轉(zhuǎn)接至6 L M9培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 h。收集菌液上清，用DEAE凝膠柱純化K抗原。將純化好的K抗原樣品凍干，用0.5 mL D2O溶解。重復凍干、D2O溶解2次。用0.5 mL D2O溶解凍干的樣品，加入對苯二甲酸二鈉5 μL(共71 μg)溶液作為內(nèi)參，充分混勻。樣品制備好后，將待測樣品裝入核磁管中，送至合肥工業(yè)大學分析測試中心檢測。使用Agilent VNMRS 600MHz 核磁共振儀檢測，光譜數(shù)據(jù)用MestReNova軟件處理譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1ZK126ΔrecA：：Kan基因敲除結(jié)果該試驗選擇ZK126ΔrecA：：Kan作為噬菌體P1供體菌。首先，采用λ-RED同源重組系統(tǒng)敲除ZK126的recA基因。以帶有卡那霉素抗性基因的pKD4為模板擴增敲除片段，電擊轉(zhuǎn)化至ZK126/pKD46電擊感受態(tài)細胞中。轉(zhuǎn)化后，挑取卡那霉素平板上的單克隆菌株進行菌落PCR檢測。泳道1為ZK126野生型菌株，目的條帶大小為1 700 bp；泳道2為ZK126ΔrecA：：Kan陽性克隆，目的條帶大小分別為1 200 bp和930 bp。由圖1可知，結(jié)果與預(yù)期相符，說明ZK126的recA基因被成功敲除。

圖1 ZK126ΔrecA：：Kan菌落PCRFig.1 ZK126ΔrecA：：Kan colony PCR

2.2kfiA基因敲除及K抗原含量檢測EcN的K抗原多糖主要由kps基因座負責合成和轉(zhuǎn)運。其中kps基因座分為3個區(qū)，負責合成的2區(qū)(kfiABCD)以及轉(zhuǎn)運的1區(qū)(kpsFEDUCS)和3區(qū)(kpsMT)[9]。在負責合成的2區(qū)基因中，kfiA表達的蛋白催化葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖的聚合，是合成莢膜多糖的必需基因。因此選擇對kfiA基因進行敲除，構(gòu)建了EcNΔkfiA：：Kan菌株，并通過輔助質(zhì)粒pCP20表達翻轉(zhuǎn)酶將其卡那霉素抗性基因去除。

1H NMR是近年來發(fā)展的一種快捷、準確地檢測K5莢膜多糖的方法[10]。為了驗證kfiA基因突變株是否能夠表達K抗原，通過1H NMR的方法檢測野生型和突變株的K抗原(K5多糖)含量。K5莢膜多糖的組成單位是[(→4)β-D-葡萄糖酸(GlcA)(1→4)N-乙酰-α-D-葡萄糖(GlcNAc)(1→)]n重復二糖單元，該二糖在1H NMR共有6個特征峰。其中，位于2.0 ppm處的峰，是由乙酰氨基葡萄糖的甲基氫所出的峰，是K5莢膜多糖最主要的特征峰。由圖2可知，EcN野生型菌株的6個K5多糖特征峰均明顯出峰，且在圖上標出。而EcNΔkfiA菌株沒有K5多糖的特征峰，說明EcNΔkfiA菌株不表達K5多糖。

圖2 1H NMR檢測K抗原含量Fig.2 Detection of K antigen content by 1H NMR

2.3K抗原對P1侵染EcN的影響通過檢測P1在侵染某種細菌時是否能夠產(chǎn)生噬菌斑，可以直接地觀察到P1是否能夠裂解該種細菌。用從ZK126制備的P1裂解液同時侵染EcN和EcNΔkfiA，檢測P1是否能夠裂解EcN和EcNΔkfiA。結(jié)果顯示，P1在EcN和EcNΔkfiA菌株中均不能產(chǎn)生噬菌斑，說明P1沒有將這2種菌裂解(結(jié)果沒有展示)。EcNΔkfiA菌株是kfiA基因突變株，不能產(chǎn)生K5多糖，說明K5多糖不是影響P1裂解EcN的決定性因素。

為了進一步驗證P1能否侵染EcN，將EcN作為P1受體菌進行轉(zhuǎn)導試驗。經(jīng)比對，大腸桿菌ZK126的recA基因上下游100 kb的DNA片段與EcN的同源性較高，因此將ZK126ΔrecA：：Kan作為供體菌，用P1包裝其基因組，轉(zhuǎn)導至EcN，將得到的陽性克隆進行菌落PCR檢測。由圖3可知，電泳條帶大小為1 200 bp和930 bp，與預(yù)期相同，P1成功將ΔrecA：：Kan片段轉(zhuǎn)導至EcN中。

注：A.菌落PCR檢測轉(zhuǎn)導結(jié)果；B.抗性平板篩選的轉(zhuǎn)導的陽性克隆Note:A.Colony PCR detection and transduction results;B.Transgenic positive clones screened by resistant plates圖3 P1轉(zhuǎn)導ZK126ΔrecA：：Kan至EcNFig.3 P1 transduction of ZK126ΔrecA：：Kan to EcN

2.4O抗原對P1侵染EcN的影響由上述結(jié)果可知，P1可以侵染EcN但是不能將其裂解，產(chǎn)生噬菌斑。因此又突變它的O抗原基因以及逐個突變其LPS的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，以探究O抗原是否是影響P1裂解EcN的決定性因素，并尋找P1的識別位點。

采用λ-RED同源重組系統(tǒng)敲除了LPS的表面聚合物連接酶基因(waaL)、Hep Ⅱ α-1，3-糖基轉(zhuǎn)移酶基因(waaG)、Glc I α-1，3-糖基轉(zhuǎn)移酶基因(waaO)以及UDP-glucose差向異構(gòu)酶基因(galE)[11]，并且構(gòu)建了kfiA與waaG，kfiA與waaO的雙基因突變株。為了檢測O抗原是否是影響P1裂解EcN的決定性因素，用P1來侵染這6株O抗原的突變株。結(jié)果顯示，P1仍然不能裂解這一系列的菌株。

2.5轉(zhuǎn)導效率檢測據(jù)報道，噬菌體侵染細菌的位點很可能位于細菌LPS的核心寡糖上。不同的O抗原基因突變株使得細菌LPS暴露出的寡糖單元也隨之不同。用P1轉(zhuǎn)導ZK126ΔrecA：：Kan至構(gòu)建的O抗原基因突變株中，通過計算轉(zhuǎn)導效率來確定P1的侵染位點。

由圖4可知，EcNΔkfiAΔwaaG：：Cm的轉(zhuǎn)導效率最高，EcNΔkfiA的效率第2，EcNΔkfiAΔwaaO：：Cm的效率第3。其余的突變株和EcN野生型作為受體菌的轉(zhuǎn)導效率基本一致。KfiA基因突變株轉(zhuǎn)導效率明顯高于野生型，說明包裹在細菌周圍的K5莢膜多糖影響P1感染細菌。waaO和waaG單基因突變株會導致LPS核心寡糖在不同的糖單元處中斷。waaO突變株會暴露出Glc I，而waaG突變株會暴露出Hep Ⅱ。單基因突變株對于轉(zhuǎn)導效率幾乎沒有影響，但是在此基礎(chǔ)上，再將kfiA基因突變，發(fā)現(xiàn)噬菌體P1的侵染效率有明顯的提升。尤其EcNΔkfiAΔwaaG：：Cm菌株，轉(zhuǎn)導效率最高，明顯高于EcNΔkfiAΔwaaO：：Cm和EcNΔkfiA菌株。由此得出結(jié)論：噬菌體P1侵染EcN的識別位點是位于LPS核心寡糖的第2位庚糖上(Hep Ⅱ)。

圖4 P1轉(zhuǎn)導recA：：Kan至EcN O抗原突變株結(jié)果Fig.4 Results of P1 transduction of recA：：Kan to EcN O antigen mutants

3 討論

該研究主要通過構(gòu)建一系列的K抗原和O抗原基因突變菌株來探究P1不能裂解EcN的原因，并且尋找P1侵染EcN的識別位點。用從ZK126菌株制備的P1裂解液來侵染構(gòu)建的一系列基因突變株，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與P1侵染EcN野生型菌株一致，均不能產(chǎn)生噬菌斑，這說明了K抗原和O抗原均不是P1不能裂解EcN的原因。

據(jù)文獻報道，P1的識別位點很可能位于LPS的核心寡糖上。不同的O抗原基因突變株會導致LPS核心寡糖的提前中斷，暴露出不同的寡糖單元。用P1轉(zhuǎn)導ZK126ΔrecA：：Kan至構(gòu)建的O抗原基因突變株中，通過計算轉(zhuǎn)導效率來確定P1的侵染位點。結(jié)果顯示，EcNΔkfiAΔwaaG：：Cm的轉(zhuǎn)導效率最高，EcNΔkfiA的效率第2，EcNΔkfiAΔwaaO：：Cm的效率第3。其余的突變株和EcN野生型作為受體菌的轉(zhuǎn)導效率基本一致。kfiA基因突變株的轉(zhuǎn)導效率均有明顯提升，說明覆蓋在EcN表面的K5莢膜多糖會影響P1侵染的效率。在將K5莢膜多糖去除后，P1能夠更好地與位于K5莢膜多糖內(nèi)、位于細胞表面的噬菌體識別受體接觸，由此導致了轉(zhuǎn)導效率的提升。此外，EcNΔkfiAΔwaaG：：Cm的轉(zhuǎn)導效率明顯高于其他2株kfiA基因突變株，說明waaG基因突變株使得Hep Ⅱ暴露了出來，而Hep Ⅱ就是噬菌體P1識別的侵染位點，因此會導致轉(zhuǎn)導效率的升高。因此認為：Hep Ⅱ就是噬菌體P1識別的侵染位點。該研究尋找到了可能的P1識別位點，為P1的后續(xù)改造和應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

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