杜戰(zhàn)國，魏 玉，龔 曼，李彥靈，禹建春，郭全建

(1.駐馬店市婦幼保健院，河南 駐馬店 463000；2.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.駐馬店市第六人民醫(yī)院，河南 駐馬店 463715)

心血管疾病是目前危害人類健康的常見疾病之一。目前研究表明，心血管疾病主要與血管內(nèi)皮細胞功能紊亂有關(guān)[1]。氧自由基引起的過氧化反應是導致血管內(nèi)皮紊亂的重要原因[2]。由于中藥的多成分、多靶點的獨特優(yōu)勢，現(xiàn)在研究熱點多從植物中尋找天然的抗氧化活性物質(zhì)。黃秋葵(Abelmoischusesculentus)為錦葵科秋葵屬咖啡黃葵植物，又名羊角豆，為一年生草本植物。現(xiàn)有研究表明，黃秋葵中黃秋葵總黃酮具有良好的抗氧化活性[3]，但其抗氧化機制目前研究較少。本研究采用過氧化氫誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)氧化應激損傷模型，探討黃秋葵總黃酮的抗氧化作用及其作用機制。

1 材料

1.1 細胞 HUVECs：中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞資源中心。

1.2 儀器 371型CO2培養(yǎng)箱：美國THERMO公司；BIO-RAD550型全自動酶標儀：美國RAPIM公司；CKX41倒置熒光顯微鏡：日本Olympus；5417D臺式高速離心機：德國Eppendorf；Tanon4100凝膠成像系統(tǒng)：上海天能公司；DYY-7C電泳儀、DYCZ-24DN小型垂直電泳槽：北京六一。

1.3 藥物與試劑 黃秋葵果實購自新鄉(xiāng)農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院李彥靈老師鑒定為錦葵科秋葵屬黃秋葵(Abelmoischusesculentus)，取黃秋葵果實，烘干后，稱取100.05 g，95%乙醇80 ℃回流提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至干燥，所得粉末為黃秋葵總黃酮，得率為1.25%。MTT：美國Sigma；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測試盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒：南京建成公司；兔抗人一抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)：北京中杉金橋公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒：上海圣研生物科技有限公司；高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒：北京康為世紀生物科技有限公司；內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)ELISA試劑盒：美國R&D公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔抗體、抗β-actin兔單克隆抗體：北京康為世紀生物科技有限公司。

2 方法

2.1 黃秋葵總黃酮對過氧化氫誘導的氧化應激損傷的保護作用 取對數(shù)生長期的HUVECs細胞，胰蛋白酶消化、離心調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，于96孔板中每孔接種100 μL，貼壁后，分別加入終濃度為0.1、0.5、1、3、5 mg/mL黃秋葵總黃酮，陽性對照組加入10 μmol/L依達拉奉，空白對照組和模型組加入等容量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)，孵育48 h后，加入終濃度為1 200 μmol/L的過氧化氫，空白對照組加入PBS，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h[4]，測定OD值，計算HUVECs細胞存活率。存活率=(各實驗組OD值/正常對照組OD值)×100%。

2.2 二氯熒光乙酰乙酸鹽法檢測細胞ROS水平 取對數(shù)生長期的HUVECs細胞，胰蛋白酶消化、離心調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，每孔接種3 mL于6孔板爬片中，貼壁后，分別加入終濃度為0.5、1、3 mg/mL黃秋葵總黃酮，陽性對照組加入10 μmol/L依達拉奉，空白對照組和模型組加入等容量的PBS，孵育48 h后，加入終濃度為1 200 μmol/L的過氧化氫，空白對照組加入PBS，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h，棄去培養(yǎng)基，加入含DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基，室溫下避光孵育20 min，取出封片，熒光顯微鏡觀察，Image J軟件分析熒光定量。

2.3 SOD、MDA、NO含量測定 取對數(shù)生長期的HUVECs細胞，胰蛋白酶消化、離心調(diào)整細胞濃度為1×104/mL，每孔接種2 mL于12孔板中，貼壁后，分別加入終濃度0.5、1、3 mg/mL黃秋葵總黃酮，陽性對照組加入10 μmol/L依達拉奉，空白對照組和模型組加入等容量的PBS，孵育48 h后，加入終濃度為1 200 μmol/L的過氧化氫，空白對照組加入PBS，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h，收集細胞上清液，按照試劑盒說明書測定SOD、MDA、NO含量。

2.4 ELISA法檢測細胞上清液中ET-1含量 取對數(shù)生長期的HUVECs細胞，胰蛋白酶消化，離心，調(diào)整細胞濃度為1×104/mL，每孔接種2 mL于12孔板中，貼壁后，分別加入終濃度0.5、1、3 mg/mL黃秋葵總黃酮，陽性對照組加入10 μmol/L依達拉奉，空白對照組和模型組加入等容量的PBS，孵育48 h后，加入終濃度為1 200 μmol/L的過氧化氫，空白對照組加入PBS，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h，收集細胞上清液，每孔加入待測細胞上清液50 μL；樣品孔中加入40 μL樣品稀釋液和10 μL樣品，空白孔除外；用封板膜封板后，37 ℃孵育反應30 min；洗滌，每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外；溫育、洗滌、顯色在450 nm測定各孔的OD值，根據(jù)樣品的OD值計算ET-1含量。

2.5 Western blot法測定細胞中eNOS的表達水平 取對數(shù)生長期HUVECs細胞，胰蛋白酶消化、離心調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，接種于6孔板內(nèi)，每孔接種3 mL細胞懸液，待貼壁后，分別加入終濃度為0.5、1、3 mg/mL黃秋葵總黃酮，陽性對照組加入10 μmol/L依達拉奉，空白對照組和模型組加入等容量的PBS，孵育48 h后，加入終濃度為1 200 μmol/L的過氧化氫，空白對照組加入PBS，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h，棄去上清，每孔加入100 μL蛋白裂解液，混合均勻后4 ℃，12 500×g離心20 min。調(diào)整總蛋白含量，取上清后加入5倍蛋白上樣緩沖液，SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜，BSA(5 g/L)封閉1 h，加入第一抗體eNOS(1∶800)，β-actin(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，后使用TBS-T漂洗。加入二抗IgG-HRP(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST漂洗后進行化學發(fā)光，暗室顯影，使用Tanon4100凝膠分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析。

3 結(jié)果

3.1 黃秋葵總黃酮對過氧化氫損傷的HUVECs存活率的影響 與正常對照組比較，模型組HUVECs存活率顯著降低(P<0.05)；黃秋葵總黃酮可顯著提高過氧化氫損傷的HUVECs存活率，其中1、3、5 mg/mL組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但5 mg/mL黃秋葵總黃酮組與3 mg/mL黃秋葵總黃酮組HUVECs存活率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。因此，后續(xù)試驗僅研究0.5、1、3 mg/mL黃秋葵總黃酮的作用。見表1。

表1 黃秋葵總黃酮對過氧化氫損傷的HUVECs存活率的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 黃秋葵總黃酮對過氧化氫損傷的HUVECs中ROS水平的影響 與正常對照組比較，模型組ROS水平顯著升高(P<0.05)；黃秋葵總黃酮各劑量組均能顯著降低ROS水平(P<0.05)。見表2。

3.3 黃秋葵總黃酮對過氧化氫損傷的HUVECs氧化應激損傷相關(guān)指標的影響 與正常對照組比較，模型組HUVECs中SOD、NO水平顯著降低(P<0.05)，MDA、ET-1水平升高(P<0.05)；與模型組比較，黃秋葵總黃酮0.5 mg/mL可顯著降低MDA水平(P<0.05)；黃秋葵總黃酮1、3 mg/mL可顯著升高HUVECs中SOD、NO水平(P<0.05)，顯著降低MDA、ET-1水平(P<0.05)。見表3。

表2 黃秋葵總黃酮對過氧化氫損傷的HUVECs中ROS水平的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3 黃秋葵總黃酮對過氧化氫損傷的HUVECs氧化應激損傷相關(guān)指標的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.4 黃秋葵總黃酮對過氧化氫損傷的HUVECs中eNOS蛋白表達水平的影響 與正常對照組比較，模型組HUVECs內(nèi)eNOS蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，黃秋葵總黃酮1、3 mg/mL可顯著增加過氧化氫損傷的HUVECs內(nèi)eNOS蛋白表達水平(P<0.05)。見圖1。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D. 0.5 mg/L黃秋葵總黃酮組；E. 1 mg/L黃秋葵總黃酮組；F. 3 mg/L黃秋葵總黃酮組；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)氧化和抗氧化過程之間的不平衡，其與許多疾病的發(fā)病密切相關(guān)[5]。氧化應激在心血管疾病的病理生理機制中起重要作用。自由基和氧化細胞損傷的增加與動脈粥樣硬化、高血壓、心力衰竭、糖尿病和高膽固醇血癥等心血管疾病有關(guān)。越來越多的研究表明，抗氧化劑可改善血管內(nèi)皮功能，通過預防低密度脂蛋白中脂質(zhì)過氧化，對血管內(nèi)皮依賴性舒張反應與內(nèi)皮細胞白細胞相互作用的調(diào)節(jié)增強[6]。本實驗使用過氧化氫刺激內(nèi)皮細胞建立內(nèi)皮細胞氧化損傷體外模型研究黃秋葵總黃酮的抗氧化和對內(nèi)皮細胞的保護作用，研究結(jié)果表明，過氧化氫引起的氧化應激損傷使HUVECs的存活率顯著降低，ROS水平顯著升高(P<0.05)；黃秋葵總黃酮可顯著提高氧化應激損傷的HUVECs的存活率，降低細胞ROS水平(P<0.05)，表明黃秋葵總黃酮具有較強的抗氧化作用。

SOD和MDA是判斷氧化應激情況的一對重要指標，SOD是抑制過氧化物產(chǎn)生的重要的抗氧化酶，MDA是脂質(zhì)過氧化物，可以對細胞產(chǎn)生損傷作用[7]。本實驗中模型組SOD水平顯著下降，MDA水平顯著升高，經(jīng)黃秋葵總黃酮作用后，SOD水平顯著升高，MDA水平顯著下降。ET-1和NO是由血管內(nèi)皮細胞合成的反映內(nèi)皮細胞功能狀態(tài)的物質(zhì)。ET-1可以收縮血管[8]，NO可以擴張血管，當血管內(nèi)皮損傷時，ET-1合成水平增高，NO水平降低[9]。本實驗研究結(jié)果表明，過氧化氫損傷內(nèi)皮細胞使ET-1水平增高，NO水平降低，黃秋葵總黃酮可降低ET-1水平，升高NO水平，起到保護內(nèi)皮細胞的作用。

eNOS是一氧化氮合酶的一種，主要合成和釋放NO[10]。本實驗中模型組eNOS表達顯著降低，而1、3 mg/L黃秋葵總黃酮可顯著上調(diào)eNOS的表達，表明黃秋葵總黃酮可通過調(diào)節(jié)eNOS的表達起到保護血管內(nèi)皮細胞的作用。

黃秋葵總黃酮可保護由過氧化氫誘導的HUVECs氧化應激損傷，其機制可能與調(diào)節(jié)SOD、MDA、ET-1、NO氧化應激相關(guān)因子，降低ROS水平，調(diào)控內(nèi)皮細胞功能相關(guān)蛋白eNOS的表達有關(guān)。本研究通過體外實驗進一步驗證了黃秋葵總黃酮抗氧化作用，初步探討了其保護血管內(nèi)皮細胞的機制，為黃秋葵總黃酮的應用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，其深入的機制還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1] 何潔英,王汝上,何潔寶,等.郁金醇提取物對過氧化氫誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化應激損傷的保護作用[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(3):223-225.

[2] 王均鵬,孟麗霞,潘黎明,等.抗衰老Klotho蛋白對過氧化氫誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用及其機制[J].中國動脈硬化雜志,2017,25(4):347-354.

[3] 李孟秋,翟俊樂,田歡,等.黃秋葵提取物體外抗氧化活性的研究[J].中國食品添加劑,2015(10):65-69.

[4] 李琦,陳熹,闞曉溪,等.復方銀杏葉顆粒改善人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化應激損傷的作用及其機制研究[J].中國中藥雜志,2016,41(4):722-727.

[5] WANG X Q, HE X M, DENG X,et al. Roles of miR-4463 in H2O2-induced oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells[J]. Mol Med Rep,2017,16(3):3242-3252.

[6] SAFAEIAN L, GHANNADI A, JAVANMARD S H, et al. The effect of hydroalcoholic extract of Ferula foetida stems on blood pressure and oxidative stress in dexamethasone-induced hypertensive rats[J].Res Pharm Sci,2015,10(4):326-334.

[7] 李霞,孟建,張麗榮,等.瑞芬太尼對過氧化氫處理臍靜脈內(nèi)皮細胞的抗氧化應激作用[J].臨床麻醉學雜志,2017,33(8):789-792.

[8] 李小紅,郭鳳霞,楊沁,等.自噬干預對低剪切應力下血管內(nèi)皮細胞eNOS和ET-1表達的影響[J].中國動脈硬化雜志,2014,22(9):875-880.

[9] 秦漢,胡志希,李琳,等.雪蓮通脈丸對冠心病氣虛血瘀證小鼠血管內(nèi)皮細胞功能相關(guān)指標ET-1、NO、ACE的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報,2016,36(2):25-28.

[10] 李先偉,郝偉,劉艷,等.紅杉醇對2型糖尿病大鼠主動脈NOX4及eNOS表達的影響[J].藥學學報,2014,49(3):329-336.

(收稿日期：2018-01-08；編輯：姚實林)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of total flavonoids fromAbelmoschusesculentuson oxidative stress injury induced by hydrogen peroxide (H2O2) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).MethodsMTT assay was used to investigate the protective effect of total flavonoids fromAbelmoschusesculentuson HUVECs. Spectrophotometry was used to measure the content of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), and nitric oxide (NO). ELISA was used to measure the content of endothelin-1 (ET-1) in cell supernatant. DCFH-DA was used to measure the level of reactive oxygen species (ROS). Western blot was used to measure the expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS).ResultsTotal flavonoids fromAbelmoschusesculentusincreased the survival rate of HUVECs with oxidative stress injury, the activity of SOD, and the level of NO; meanwhile, it reduced the levels of MDA, ET-1, and ROS in cells and increased the expression of eNOS.ConclusionTotal flavonoids fromAbelmoschusesculentusexert a protective effect against H2O2-induced oxidative stress injury in HUVECs, possibly by regulating oxidative stress factors (SOD, MDA, ET-1, and NO) and the expression of eNOS, the protein associated with endothelial cell function.

[Keywords]Abelmoschusesculentus; Total flavonoids; Oxidative stress injury; Human umbilical vein endothelial cell; endothelial nitric oxide synthase