李 寧，張克勤，彭侃夫

(1.重慶大學附屬中心醫(yī)院/重慶市急救醫(yī)療中心/重慶市第四人民醫(yī)院內(nèi)分泌腎內(nèi)科 400014； 2.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院腎科，重慶 400038)

尿毒癥是慢性腎衰竭(chronic kidney disease，CKD)等多種腎臟疾病轉(zhuǎn)歸的最終形式。對尿毒癥患者機體產(chǎn)生嚴重致病作用的主要是潴留堆積的各種無機或有機分子，被稱為尿毒癥毒素。按來源來分，主要包括本來就需排泄的有毒物質(zhì)和機體正常所需由于排除障礙導致含量劇增的物質(zhì)，前者的代表性分子有尿素、肌酐，而甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)是后者的典型代表[1]。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，PTH可以誘導人血管內(nèi)皮細胞發(fā)生內(nèi)皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)[2]，既可以觀察到細胞形態(tài)發(fā)生纖維化轉(zhuǎn)變，又可以檢測到EndMT一系列標志分子的表達改變，包括血管內(nèi)皮細胞標志分子血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)和CD31的表達降低，纖維細胞標志分子α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達升高，提示尿毒癥患者血清中較高水平的PTH可能通過誘導血管內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT來產(chǎn)生對心血管的損傷，但是其中的分子機制尚不清楚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)作為轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號下游效應蛋白，其激活與EndMT密切相關[3-5]。因此，本研究進一步利用TGF-β及ILK的抑制劑，探討TGF-β/ILK通路在PTH誘導EndMT中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人主動脈血管內(nèi)皮細胞(HAECs)及內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基購自美國Lifeline Cell Technology公司。PTH購自美國Anaspec公司(貨號：27080)，按照說明書溶解于無菌水中。TGF-β抑制劑SB431542、Pirfenidone(PFD)購自美國Selleck公司，ILK抑制劑Cpd22購自美國Millipore公司，均按照說明書溶解于二甲基亞砜(DMSO)中。蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)所用抗體包括VE-cadherin(美國Cell Signaling Technology公司，貨號：2500)，CD31(美國Cell Signaling Technology公司，貨號：3528)，α-SMA(美國Abcam公司，貨號：ab5694)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(美國Proteintech公司，貨號：60004-1)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及刺激處理 取對數(shù)生長期的HAECs接種于6孔細胞培養(yǎng)板中(3×105個/孔)，置于CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同步靜止12 h后開始加入誘導刺激因素：PTH誘導組加入PTH至終濃度1×10-8mol/L，對照組加入等體積的注射用水；抑制劑組分別加入不同濃度的抑制劑，對照組和單獨加PTH的實驗組(PTH實驗組)同時加入DMSO(1∶1 000)作為抑制劑的溶劑對照。誘導刺激處理36 h后，收取各組細胞分別對各個標志分子的蛋白水平進行檢測。

1.2.2Western blot 吸去細胞培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，加入1×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液吹下細胞，轉(zhuǎn)移至EP管中，冰上超聲30 s，煮沸10 min，即為全細胞裂解液，于-80 ℃保存；取適量蛋白裂解液上樣進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，冰浴條件下電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉[Tris緩沖鹽水/吐溫(TBS/T)配制]室溫封閉2 h；加一抗工作液，4 ℃反應過夜；加辣根過氧化酶標記的二抗工作液，室溫反應1 h；化學發(fā)光法顯示目標條帶。采用Image J軟件對Western blot目標條帶進行灰度掃描。

2 結(jié) 果

2.1TGF-β抑制劑作用后HAECs內(nèi)皮細胞標志物的表達 為了探討TGF-β通路在PTH誘導HAECs細胞發(fā)生EndMT中的作用，采用TGF-β的兩種抑制劑SB431542和PFD抑制TGF-β通路，檢測HAECs內(nèi)皮細胞標志物VE-cadherin和CD31蛋白水平的改變。由圖1可見，1×10-8mol/L的PTH誘導刺激后，HAECs細胞中VE-cadherin和CD31的蛋白水平均出現(xiàn)明顯降低。隨著TGF-β抑制劑 PFD和SB431542的加入，VE-cadherin和CD31的蛋白水平有明顯的恢復，并且隨著抑制劑濃度的增加，VE-cadherin和CD31的蛋白表達水平也隨之升高。

A：Western blot蛋白條帶；B：蛋白條帶進行灰度掃描后以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白相對表達水平;*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與PTH實驗組比較

圖1 TGF-β抑制劑作用后HAECs內(nèi)皮細胞標志物的表達

A：Western blot蛋白條帶；B：蛋白條帶進行灰度掃描后以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白相對表達水平；*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與PTH實驗組比較

圖2 TGF-β抑制劑作用后HAECs細胞纖維化標志物的表達

2.2TGF-β抑制劑作用后HAECs細胞纖維化標志物的表達 進一步檢測HAECs中α-SMA蛋白水平在TGF-β抑制劑SB431542和PFD干預處理后的表達改變。由圖2可見，1×10-8mol/L的PTH誘導刺激后，HAECs細胞中α-SMA的蛋白表達水平出現(xiàn)了明顯升高。隨著TGF-β通路抑制劑SB431542和PFD的加入，α-SMA的蛋白水平出現(xiàn)了明顯的降低，并且隨著抑制劑濃度的增加，α-SMA的蛋白水平出現(xiàn)劑量依賴性下降，幾乎恢復到對照組的水平。

A：Western blot蛋白條帶；B：蛋白條帶進行灰度掃描后以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白相對表達水平；*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與PTH實驗組比較

圖3 ILK抑制劑作用后HAECs內(nèi)皮細胞標志物的表達

A：Western blot蛋白條帶；B：蛋白條帶進行灰度掃描后以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白相對表達水平；*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與PTH實驗組比較

圖4 ILK抑制劑作用后HAECs纖維化標志物的表達

2.3ILK抑制劑作用后HAECs內(nèi)皮細胞標志物的表達 為了探討ILK在PTH誘導HAECs細胞發(fā)生EndMT中的作用，采用ILK抑制劑Cpd22處理細胞，檢測HAECs內(nèi)皮細胞標志物VE-cadherin和CD31蛋白水平的改變。由圖3可見，1×10-8mol/L的PTH誘導HAECs細胞中VE-cadherin和CD31蛋白水平出現(xiàn)明顯降低，隨著ILK抑制劑Cpd22的加入，VE-cadherin和CD31的蛋白水平有比較明顯的恢復，并且隨著抑制劑濃度劑量的增加，VE-cadherin和CD31的蛋白表達水平出現(xiàn)劑量依賴性的增加。

2.4ILK抑制劑作用后HAECs細胞纖維化標志物的表達 進一步檢測HAECs中α-SMA蛋白水平在ILK抑制劑Cpd22干預條件下的改變。由圖4可見，1×10-8mol/L的PTH刺激使HAECs細胞中α-SMA的蛋白水平出現(xiàn)明顯升高，隨著ILK抑制劑Cpd22的加入，α-SMA的蛋白表達水平出現(xiàn)明顯的降低，并且隨著抑制劑濃度劑量的增加，α-SMA的蛋白水平出現(xiàn)更加明顯的下降。

3 討 論

文獻表明，大多數(shù)早期和晚期CKD患者血清PTH水平明顯升高[6-7]。而PTH是由甲狀旁腺主細胞分泌的一種激素，主要調(diào)節(jié)人體鈣、磷代謝，對健康人體內(nèi)沒有危害。但是，由于尿毒癥患者正常腎功能受損，不但引起PTH降解減緩，排泄也難以正常進行。因此，PTH不斷在患者體內(nèi)積蓄。并且患者大多鈣磷代謝紊亂(由腎衰竭引起)，患者血清鈣離子水平降低、血磷水平升高，PTH在刺激下分泌增加，進一步誘發(fā)PTH的蓄集。這些變化，會導致多種并發(fā)癥，主要有繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、皮膚瘙癢、轉(zhuǎn)移性鈣化、腎性骨病和周圍神經(jīng)病變等。已有大量文獻報道，PTH受體存在于成纖維細胞和心肌細胞表面。此外，PTH也可作用于心肌。早期的研究發(fā)現(xiàn)，PTH是導致心肌間質(zhì)纖維化的重要因素，而這由患者體內(nèi)過高的PTH導致心肌間質(zhì)的非修復性纖維化及膠原堆積引起。

細胞發(fā)生EndMT時，細胞丟失其內(nèi)皮細胞標志蛋白VE-cadherin和CD31等，獲得性表達間充質(zhì)細胞標志物α-SMA等[8-10]。本實驗結(jié)果表明，在PTH作用下血管內(nèi)皮細胞HAECs的VE-cadherin和CD31表達降低(圖1、3)，而α-SMA的表達變化則相反(圖2、4)，說明PTH作為尿毒癥毒素，可以減弱HAECs的內(nèi)皮細胞特征，同時增強纖維化的特征，誘導HAECs發(fā)生較明顯的EndMT。

TGF-β是一種生長調(diào)節(jié)因子，具有多種細胞生物學功能。TGF-β的分泌方式有多種，主要有自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌3種方式；TGF-β主要調(diào)控細胞分化、增殖、凋亡以及細胞外基質(zhì)，也可深入調(diào)控組織形成、分化等；TGF-β可與細胞表面受體結(jié)合，從而傳導信號。研究發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)纖維化與TGF-β1功能密切相關，TGF-β1是誘導EndMT發(fā)生的關鍵因子之一[5,11-12]。有研究表明，TGF-β可誘導小鼠胚胎干細胞來源的EndMT[13]。此外，血管內(nèi)皮細胞的增殖和表型轉(zhuǎn)化也可由TGF-β刺激產(chǎn)生，主要表型是成纖維細胞分子標志α-SMA水平升高、內(nèi)皮細胞標志蛋白CD31表達則明顯下調(diào)[14-15]。本研究主要針對HAECs運用PTH刺激誘導，并額外使用TGF-β信號通路抑制劑SΒ431542和PFD。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTH誘導HAECs發(fā)生的EndMT可被抑制劑SΒ431542和PFD逆轉(zhuǎn)，如HAECs內(nèi)皮細胞標志分子減少(圖1)、纖維化分子標志增加(圖2)。結(jié)果提示，PTH誘導HAECs發(fā)生EndMT可能受到TGF-β信號通路的有效調(diào)控。

學術(shù)界已發(fā)現(xiàn)，TGF-β調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生，Smad依賴性及非Smad依賴性是兩種主要的信號通路[16]。非Smad依賴性通路涉及多種激酶通路，包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-絲裂原活化蛋白激酶(ERK-MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)和Rho激酶等[16]。最近的研究表明，與表型轉(zhuǎn)變相關的TGF-β信號下游蛋白主要是ILK[3]。SERRANO等[3]發(fā)現(xiàn)，當乳腺上皮細胞內(nèi)發(fā)生EMT，往往伴隨ILK表達水平明顯升高，通過阻斷ILK可以有效逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化過程。上述研究表明，ILK是TGF-β1誘導EMT發(fā)生的極為重要的下游分子。另有研究嘗試對腎小管上皮細胞采用TGF-β1干預，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞原型丟失，間充質(zhì)細胞標志表達則明顯升高，而這一表型變化可應用小分子QLT-0267(ILK抑制劑)有效抑制[17]。已有報道指出，內(nèi)皮細胞與上皮細胞具有一定的同源性[9]，筆者前期的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)HAECs的ILK水平可由PTH刺激升高[2]，為深入研究ILK在這一過程中的作用，筆者首先運用PTH誘導刺激HAECs，再加入小分子物質(zhì)Cpd22(ILK抑制劑)干預，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cpd22可逆轉(zhuǎn)PTH引發(fā)的HAECs的內(nèi)皮細胞分子標志物的減少和纖維化標志蛋白的增加。這一結(jié)果表明，ILK信號活化在PTH誘導HAECs發(fā)生EndMT過程中起著重要的作用。

綜上所述，PTH可明顯誘導出HAECs發(fā)生EndMT，而且TGF-β/ILK信號通路參與調(diào)控EndMT過程。從臨床價值來看，血管內(nèi)皮細胞的EndMT可顯著降低血管彈性、增加血管硬化，導致心血管系統(tǒng)損傷，對機體造成很大的危害。未來TGFβ/ILK通路可能作為抑制血管內(nèi)皮細胞發(fā)生EndMT的治療靶點，用于預防尿毒癥患者的心血管損傷。

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