王會品，張明明，陸天宇，王 珂，孫世珺，王慧君

(1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣州 510515；2.中山市人民醫(yī)院分子診斷中心，廣東中山 528403； 3.淮安市公安局，江蘇淮安 223001；4.啟東市公安局，江蘇南通 226000；5.南京市公安局 210000)

人類Y染色體屬于性染色體，其遺傳標(biāo)記幾乎不發(fā)生回復(fù)突變，其序列結(jié)構(gòu)特征能穩(wěn)定地由父親傳給兒子，呈父系遺傳。因此，在法醫(yī)學(xué)個(gè)體識別、親子鑒定、混合斑中男性成分的檢測、種族起源、群體進(jìn)化和民族遷移等方面都具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。在Y染色體各種標(biāo)記中，短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，STRs)由于具有高多態(tài)性和高突變能力而被廣泛使用，且Y-STRs可進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增。目前為止，Y-STR單倍型參考數(shù)據(jù)庫(YHRD)已經(jīng)獲得大規(guī)模的Y-STR數(shù)據(jù)，以便為法醫(yī)提供可靠的Y-STR單倍型頻率(https://yhrd.org)。在公安機(jī)關(guān)，Y-STR單倍型分析用于追蹤潛在家系中的男性嫌疑犯，通過相同或高度相似的Y-STR單倍型提供犯罪證據(jù)[1-2]。江蘇省位于人群流動較大的長三角區(qū)域，是中國23個(gè)省份中人群最密集的地區(qū)，其復(fù)雜的文化背景和極其密集的人群亟需最新的Y-DNA分型技術(shù)為法醫(yī)學(xué)親緣排查提供信息，分析江蘇漢族和世界各地其他人群的基因血緣關(guān)系。為了研究江蘇漢族人群Y-STR的生物地理分布，筆者通過PowerPlex?Y23系統(tǒng)對13個(gè)地級市916名男性進(jìn)行分型，分析江蘇人群內(nèi)部的分化，并與18個(gè)東亞人群對比。

1 資料與方法

1.1一般資料 共916名健康漢族男性在知情同意的情況下提供血液標(biāo)本，其中常州207例、徐州147例、宿遷111例、無錫98例、連云港71例、鹽城62例、淮安55例、蘇州47例、南京41例、南通39例、鎮(zhèn)江17例、揚(yáng)州14例、泰州7例。均來自江蘇漢族人群且為無關(guān)個(gè)體，至少三代居住在當(dāng)?shù)?。采用Chelex-100法提取基因組DNA。

1.2方法

1.2.1STRs基因分型 試劑盒采用PowerPlex?Y23系統(tǒng)(美國Promega公司)。在美國Thermo Fisher Scientific公司9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行多重PCR，在ABI3130XL DNA遺傳分析儀上對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)電泳檢測，并使用GeneMapperID-X軟件進(jìn)行基因型分析。

1.2.2質(zhì)量控制 本實(shí)驗(yàn)室的Y-STR基因分型能力通過YHRD對于Y-STR單倍型質(zhì)量檢測。本文群體登記號為YA004256(https://yhrd.org)。經(jīng)YHRD修正后，在遺傳距離(RST)分析中去除了無效值、中間等位基因和基因拷貝數(shù)變異。根據(jù)國際法醫(yī)遺傳學(xué)會(ISFG)推薦、SCHNEIDER[3]提供的DNA多態(tài)性建議進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Arlequin 3.0的直接計(jì)數(shù)法對Y-STR基因座等位基因頻率和單倍型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，根據(jù)Neis的方法計(jì)算基因多樣性(GD)[4]。計(jì)算法醫(yī)學(xué)參數(shù)：單倍型多樣性(HD)、識別能力(DC)和匹配概率(MP)。多拷貝基因座DYS385a/b常被用來分析組合單倍型。減去DYS389Ⅰ后，得到DYS389Ⅱ的等位基因。所計(jì)算的RST數(shù)值指小組內(nèi)隨機(jī)選擇的等位基因相對于整個(gè)組的相似度，并使用YHRD推薦的多維標(biāo)度圖和Mega 6.0對鄰接樹進(jìn)行可視化。基于RST值矩陣，采用MASS程序包(https://cran.r-project.org/web/packages/MASS/index.html)繪制MDS插圖并獲取初始值。

2 結(jié) 果

2.1單倍型和法醫(yī)學(xué)參數(shù) 共發(fā)現(xiàn)912例不同的單倍型，包括908例(99.6%)單獨(dú)的單倍型和4例(0.4%)重復(fù)出現(xiàn)2次的單倍型。此外,在DYS448和DYS456中觀察到2個(gè)無效等位基因。另外，還發(fā)現(xiàn)3個(gè)微變異，即DYS458的16.1、DYS385的16.2、DYS448的19.2，都已在YHRD數(shù)據(jù)庫中獲得驗(yàn)證。

等位基因數(shù)目最少為DYS437的5個(gè)，最多為DYS458的13個(gè)，而且在DYS385a/b觀察到76個(gè)不同的等位基因組合，除了DYS391、DYS438和DYS437，所有基因座的GD值都高于0.5。DYS385的GD值最高為0.960 7，因?yàn)樵撐稽c(diǎn)是由76個(gè)不同等位基因組成的多拷貝基因座(表1)；最低的位于DYS438為0.394 2，因?yàn)樵摶蜃系任换?0的等位基因頻率在所有基因座中最高，為0.753 3。

表1 江蘇漢族人群多拷貝DYS385位點(diǎn)單倍型的頻率分布及法醫(yī)學(xué)參數(shù)(n=916)

GD：基因雜合度

2.2連鎖不平衡分析 江蘇漢族23個(gè)Y-STR的連鎖不平衡分析見圖1。在253個(gè)成對比較中，233個(gè)顯示出連鎖不平衡(黑邊紅色區(qū)域)狀態(tài)，占92.1%。

圖1 江蘇漢族23個(gè)Y-STR的連鎖不平衡分析

2.3人群內(nèi)差異 江蘇省10個(gè)地級市的成對RST遺傳距離和顯著性差異見表2。鎮(zhèn)江、揚(yáng)州、泰州漢族人群因樣本量小，無法反映其地區(qū)綜合的遺傳背景特征而被排除。這10個(gè)地區(qū)之間幾乎沒有差異。遺傳距離最小的是徐州漢族與南通漢族(RST=0.000 0，P=0.144 1)，連云港漢族與南通漢族的遺傳距離最大(RST=0.029 2，P=0.045 1)。另外，徐州漢族和無錫漢族(RST=0.010 1，P=0.000 0)，鹽城漢族和無錫漢族(RST=0.015 3，P=0.036 0)，連云港漢族和無錫漢族(RST=0.012 8，P=0.036 0)，鹽城和南通漢族(RST=0.026 9，P=0.018 0)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Bonferroni校正，只有無錫漢族和徐州漢族之間仍有明顯差異(P=0.000 9)。江蘇10個(gè)地級市的最佳鄰接樹，見圖2。分枝長度之和(SBL)為0.015 663 28。鄰接樹中的10個(gè)江蘇漢族人群并不符合地理分布。這一系統(tǒng)的重建顯示了淮安和無錫漢族、南通和宿遷漢族之間的密切關(guān)系，南京與鹽城漢族聯(lián)系最緊密，其次是與連云港漢族、再次是與蘇州漢族。為進(jìn)一步驗(yàn)證，繪制多維標(biāo)度圖，其初始值達(dá)到0.008 24，表明結(jié)構(gòu)重建水平為完美(圖3)，受到認(rèn)可。鹽城漢族和連云港漢族，南通漢族和無錫漢族之間的遺傳關(guān)系與鄰接樹類似。此外，無錫、蘇州、常州、南京漢族分散在多維標(biāo)度圖中。

表2 江蘇省13個(gè)地級市多個(gè)漢族人群RST值遺傳距離矩陣

+：P<0.05；-：P>0.05；對稱軸上：對應(yīng)的P值；對稱軸下：RST值；*：無數(shù)據(jù)

圖2 江蘇10個(gè)地級市的最佳鄰接樹

2.4人群外差異 分析江蘇漢族人群和其他18個(gè)東亞人群(北京漢族、成都漢族、群馬日本人、京族、茨城日本人、呂宋菲律賓人、菲律賓人、汕頭漢族、靜岡日本人、新加坡漢族、新加坡印度人、新加坡馬來西亞人、韓國人、南方漢族、東京日本人、傣族、宣威漢族、白族)的差異。江蘇漢族人群內(nèi)部的數(shù)值均小于0.000 3(Bonferroni校正值的0.05/171)。江蘇漢族人群與其他18個(gè)人群的成對RST值大于江蘇漢族人群內(nèi)部數(shù)值。江蘇漢族人群與茨城日本人(RST=0.034 1，P=0.000 0)、呂宋島菲律賓人(RST=0.009 5，P=0.000 0)、汕頭漢族(RST=0.090 6，P=0.000 0)、新加坡漢族(RST=0.041 0，P=0.000 0)、新加坡印度人(RST=0.113 6，P=0.000 0)、新加坡馬來西亞人(RST=0.079 9，P=0.000 0)和韓國人(RST=0.018 2，P=0.000 0)有明顯差異。剩下11個(gè)人群，包括4個(gè)中國漢族，與江蘇漢族人群的遺傳距離都很接近。與地理位置一致，新加坡印度與江蘇漢族的遺傳距離最大。

圖3 江蘇省10個(gè)地級市的多維標(biāo)度圖

此外，繪制上述人群的鄰接樹(圖4)和多維標(biāo)度圖(圖5)，并標(biāo)注語言的親緣關(guān)系。19個(gè)東亞人群的分支長度測試結(jié)果(SBL=0.071 320 81)大于江蘇省13個(gè)市的結(jié)果。系統(tǒng)發(fā)育樹清楚表明，江蘇漢族和傣族來自同一個(gè)節(jié)點(diǎn)，其次是宣威漢族和北京漢族，都屬于漢藏語系。源自阿爾泰語系的5個(gè)人群(群馬日本人、靜岡日本人、韓國人、東京日本人和茨城縣日本人)相距較近，與含有江蘇漢族的那束相比，位于鄰接樹的另一側(cè)。

圖4 江蘇漢族和19個(gè)東亞人群的鄰接樹

圖5 江蘇漢族和19個(gè)東亞人群的多維標(biāo)記圖

如圖5所示，多維標(biāo)度圖的初始值為0.106 7，具有良好的可信度。江蘇漢族、北京漢族、成都漢族和新加坡漢族人群聚集在左下象限中。此外，江蘇漢族距群馬日本群體、靜岡日本群體和東京日本群體較遠(yuǎn)，大致符合鄰接樹的結(jié)果。結(jié)構(gòu)重建表明，江蘇漢族與北京漢族(北方漢族)的關(guān)系最密切。

3 討 論

在人類群體遺傳學(xué)中，遺傳距離是群體間遺傳差異和遺傳分化的重要指標(biāo)。系統(tǒng)發(fā)生樹常用來描述某一群有機(jī)體發(fā)生或進(jìn)化關(guān)系的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可直觀地描述人種或群體之間的進(jìn)化關(guān)系。本研究對916名來自江蘇漢族無關(guān)個(gè)體的健康男性DNA樣品進(jìn)行23個(gè)Y-STR基因分型?？偣舶l(fā)現(xiàn)912例不同的單倍型，其中包括908例單獨(dú)的單倍型(99.6%)和4例重復(fù)出現(xiàn)2次的單倍型(0.4%)，表明PowerPlex?Y23系統(tǒng)中包含的23個(gè)Y-STR在江蘇漢族人群中具有高度多態(tài)性(HD=0.999 995 2)，法醫(yī)學(xué)應(yīng)用也有極大的價(jià)值(DC=0.995 6，MP=0.001 1)。GD值最高為DYS385的0.960 7，最低值為DYS438的0.394 2。連鎖不平衡分析詳細(xì)地闡述了將這些標(biāo)記物作為單倍型分析的必要性。與江蘇漢族人群相似，DYS438等位基因10的頻率在遼寧漢族、廣東漢族、湘南韓族和韓國的相同位點(diǎn)中也最高。然而，其根本原因尚不清楚，這種遺傳現(xiàn)象可能與群體遺傳學(xué)中的人群瓶頸有關(guān)，從而導(dǎo)致遺傳漂移[6]。同樣，這也可能是由始祖效應(yīng)引起，從新成立的群體角度來看，后代的遺傳多樣性嚴(yán)重依賴于早期的大量移民[7]。因此，隨機(jī)化可能導(dǎo)致人群中最多數(shù)的等位基因不同。除去DYS385、DYS458的GD值最高，因其在單拷貝基因座中具有最多的等位基因。各種法醫(yī)學(xué)參數(shù)的分布表明，江蘇漢族人群遺傳多樣性較高。

徐州和無錫地理位置相距較遠(yuǎn)，分別位于江蘇省最北部和最南部，這導(dǎo)致重大遺傳分化。來自蘇南的漢族人群與來自蘇北的漢族人群關(guān)系密切，這證明了江蘇漢族人群的同質(zhì)性很高。多維標(biāo)度圖的結(jié)果與鄰接樹重建結(jié)果一致。常州、連云港、南通漢族人群在第1、2維度上是3個(gè)異常值，可能原因是這3個(gè)地級市均位于江蘇省的邊緣地區(qū)，與鄰近省份的人群有頻繁的基因交換。將蘇南和蘇北漢族人群基因聯(lián)系起來，發(fā)現(xiàn)蘇南吸收了許多來自蘇北的流動人口。江蘇省10個(gè)地級市漢族人群的遺傳特征主要有兩個(gè)方面：(1)蘇南和蘇北漢族人口的顯著差異；(2)現(xiàn)代生活方式不斷影響蘇南各族人群的人群結(jié)構(gòu)，另外從基因流動的角度，江蘇漢族人群頻繁的交互將其聯(lián)系到一起。

在人類起源的研究中，東亞地區(qū)一直是研究人類起源與遷徙過程中的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)。東亞人群中一系列的mtDNA研究顯示，東亞現(xiàn)代人群來源于一個(gè)共同的祖先群體。從亞洲有限數(shù)量群體的mtDNA多態(tài)的研究表明，東亞人群起源于同一祖先[8-11]。在東亞人群水平上，只有淮安漢族和南通漢族的人群數(shù)據(jù)和相應(yīng)的遺傳背景此前被收集和分析過[12]，發(fā)現(xiàn)江蘇漢族人群與全國范圍內(nèi)漢族群體的遺傳關(guān)系很近。綜合考慮考古學(xué)分析、Y染色體單核苷酸多態(tài)性、常染色體短串聯(lián)重復(fù)序列和常染色體單核苷酸多態(tài)性的分析，中國北方和南方漢族之間存有顯著差異[13]。考慮到江蘇省處于南北方的邊緣地帶，并且有復(fù)雜的歷史人群變動，江蘇漢族人群來自南方還是北方仍無定論。結(jié)合鄰接樹和多維標(biāo)度圖，本研究對江蘇漢族內(nèi)部和江蘇漢族與所引用18個(gè)東亞人群的成對RST遺傳距離和P值進(jìn)行了分析，客觀地說明了江蘇漢族人群的遺傳背景。筆者第一次描繪了江蘇漢族人群的內(nèi)在差異和遺傳特征。另外，就東亞層面而言，江蘇漢族人群主要來自北方漢族。

綜上所述，本研究通過分型916例個(gè)體23個(gè)Y-STR遺傳標(biāo)記，豐富了江蘇漢族的法醫(yī)學(xué)分子數(shù)據(jù)庫，有利于推動對人群遺傳學(xué)和分子人類學(xué)的認(rèn)識。本研究初步闡述了江蘇漢族人群的內(nèi)部和人群間遺傳結(jié)構(gòu)。為了更好地推斷江蘇漢族的起源和分布，筆者建議對不同遺傳標(biāo)記進(jìn)行更多的基因分型。本研究的局限性在于江蘇人群內(nèi)部的樣本量不一致，可能對結(jié)構(gòu)重建有一定影響。接下來，筆者將從江蘇漢族人群中選出更具代表性的樣本，以更全面、更科學(xué)地從法醫(yī)學(xué)角度解釋江蘇漢族遺傳背景與人群交互。

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