王 凡，白 羽，于詠蘭

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

急性期反應(yīng)被認(rèn)為是宿主先天防御系統(tǒng)中重要的一部分，該反應(yīng)的發(fā)生遠(yuǎn)早于獲得性免疫，任何破壞體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的組織刺激都可能導(dǎo)致其發(fā)生。C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)是一種急性期反應(yīng)蛋白，最早在人體中被發(fā)現(xiàn)，因其對(duì)肺炎球菌C多糖體產(chǎn)生反應(yīng)而被命名為“C-反應(yīng)蛋白”。當(dāng)出現(xiàn)急性期反應(yīng)時(shí)，CRP濃度上升十分迅速，在24 h～48 h即可達(dá)到峰值。因CRP的半衰期很短，所以當(dāng)急性期反應(yīng)的誘因被處理后，CRP又可被迅速清除[1]，所以CRP被用于人類多種疾病的診斷中。與人類疾病相似，CRP也是犬疾病過(guò)程中一個(gè)主要的急性期反應(yīng)蛋白，其血清濃度不受年齡和性別因素影響[1]，健康的懷孕犬和肥胖犬中可能會(huì)有輕度升高[2]。

雖然已證實(shí)，手術(shù)、創(chuàng)傷、某些感染性疾病、血液寄生蟲病、某些免疫介導(dǎo)性疾病、腫瘤性疾病會(huì)導(dǎo)致犬CRP濃度升高[1,3-6]，但目前獸醫(yī)臨床工作中，仍急需犬在患有對(duì)其危害很大、發(fā)病率較高的細(xì)小病毒、冠狀病毒、犬瘟熱病毒及寄生蟲等感染時(shí)，CRP對(duì)疾病診斷與預(yù)后的應(yīng)用指導(dǎo)。本文通過(guò)檢測(cè)與分析犬患有上述疾病時(shí)血液樣本中CRP的變化，彌補(bǔ)了這一空白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取2016年10月至2017年6月間，經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院確診的、患有犬細(xì)小病毒50例、犬冠狀病毒13例、消化道寄生蟲感染8例、胰腺炎17例、其他原因(非犬細(xì)小病毒、犬冠狀病毒、寄生蟲感染、胰腺炎)導(dǎo)致的胃腸炎10例、犬瘟熱病毒32例、非犬瘟熱病毒引起的呼吸道感染病例27例，分設(shè)為試驗(yàn)組，同時(shí)選取15只健康犬為健康對(duì)照組。所有患病動(dòng)物的確診通過(guò)臨床檢查、實(shí)驗(yàn)室診斷等綜合進(jìn)行。對(duì)照組犬只通過(guò)臨床檢查、血常規(guī)、生化檢查及電話尋訪采樣前后各10 d生活狀態(tài)均無(wú)異常而確定。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 犬C-反應(yīng)蛋白分析儀，北京勤邦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，型號(hào)KIA0601Y；全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀，日本希森美康株式會(huì)社生產(chǎn)，型號(hào)pocH-100i；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，美國(guó)愛(ài)德士生物科技公司生產(chǎn)，型號(hào)ProCyte DxTM；生化分析儀，美國(guó)愛(ài)德士生物科技公司生產(chǎn)，型號(hào)VetTestTM；顯微鏡，日本奧林巴斯公司生產(chǎn)，型號(hào)CX21；膠體金試紙條(犬細(xì)小病毒、犬冠狀病毒、犬瘟熱病毒)，韓國(guó)ASAN PHARM公司生產(chǎn)；犬胰腺炎快速檢測(cè)試劑，美國(guó)愛(ài)德士生物科技公司生產(chǎn)，型號(hào)SNAP cPLTM；X線攝影系統(tǒng)，西班牙賽德科醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號(hào)3000-F；PCR儀，臺(tái)灣金瑞鴻捷生物科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)tacoTM。

1.2 方法

1.2.1 C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)方法 CRP的檢測(cè)使用北京勤邦生物技術(shù)有限公司出產(chǎn)的C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試紙板及分析儀進(jìn)行。采集犬外周靜脈血，制備血漿或血清樣本后立即測(cè)定或在-80℃保存，3個(gè)月內(nèi)檢測(cè)完畢。檢測(cè)時(shí)取4 μL血漿/血清樣本于稀釋管內(nèi)，充分混勻。再取10 μL稀釋樣本滴于試劑板上相應(yīng)部位反應(yīng)5 min，后使用配套免疫層析分析儀讀取檢測(cè)結(jié)果。本次的犬CRP檢測(cè)采用雙抗體夾心法原理進(jìn)行。

該方法下廠家給出的CRP檢測(cè)范圍為5 mg/L～200 mg/L。對(duì)于在檢測(cè)中出現(xiàn)的檢測(cè)值低于5 mg/L的數(shù)值都以5 mg/L來(lái)計(jì)算，使檢測(cè)組與對(duì)照組的差異顯著性比較更合理。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 采集所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液，進(jìn)行CRP測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞總數(shù)的檢測(cè)，并比較在整個(gè)病程中同一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的CRP和WBC數(shù)值與變化趨勢(shì)，WBC正常范圍使用通用標(biāo)準(zhǔn)(5.05～16.76)×109/L。所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用非參數(shù)檢驗(yàn)的方法，通過(guò)卡方檢驗(yàn)比較二分類資料間的差異性，分析差異性時(shí)，P<0.05時(shí)為差異顯著，P<0.01時(shí)為差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 各種疾病組CRP值與差異性分析

細(xì)小病毒感染、冠狀病毒感染、胰腺炎、消化道寄生蟲感染、其他原因?qū)е碌奈改c炎、犬瘟熱病毒感染、非犬瘟熱病毒(CDV)引起的呼吸道感染均可見(jiàn)不同程度的CRP值上升。與健康對(duì)照組相比，除了消化道寄生蟲組外的所有檢測(cè)組CRP平均值都有顯著升高。冠狀病毒組，胰腺炎組，消化道寄生蟲組，其他原因引起的胃腸炎組間的CRP平均值沒(méi)有顯著性差異。消化道寄生蟲組中，檢測(cè)到了毛滴蟲、賈第蟲、絳蟲、球蟲，在本研究中毛滴蟲和賈第蟲感染患犬的CRP值升高趨勢(shì)顯著。犬瘟熱病毒組、非CDV引起的呼吸道感染組的CRP平均值之間沒(méi)有顯著性差異(表1和表2)。

2.2 疾病預(yù)后與CRP值

細(xì)小病毒組共有13例患犬死亡(26.00%)，37例患犬存活(74.00%)。細(xì)小病毒存活組的CRP平均值為65.35 mg/L±3.53 mg/L，為健康組CRP濃度的12.54倍，死亡組為93.74 mg/L±6.50 mg/L，為健康組CRP濃度的18倍。與存活組相比較，死亡組CRP平均值顯著上升(P<0.01)。

表1 有消化道癥狀相關(guān)疾病組的CRP范圍和平均值

注：同行中標(biāo)有不同小寫字母的均數(shù)間差異顯著，即P<0.05；同行中有一個(gè)字母相同的均數(shù)間表示差異不顯著，即P>0.05。

Note：In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference，P<0.05,while with the same letter superscripts mean no significant difference，P>0.05.

表2 犬瘟熱病毒組和非CDV引起的呼吸道感染組的CRP范圍和平均值

注：同行中標(biāo)有不同小寫字母的均數(shù)間差異顯著，即P<0.05；同行中有一個(gè)字母相同的均數(shù)間表示差異不顯著，即P>0.05。

Note：In the same row,values with different small letter superscripts mean significant difference，P<0.05,while with the same letter superscripts mean no significant difference，P>0.05.

冠狀病毒組出現(xiàn)1例死亡(7.69%)，CRP濃度為該組最高值113.68 mg/L，犬瘟熱組共有4例患犬死亡(12.50%)，其中2例患犬為早期出現(xiàn)高水平的CRP值(≥104 mg/L)，另外2例為在犬瘟熱病程末期出現(xiàn)抽搐時(shí)，測(cè)得的CRP值依舊高于正常范圍(>10 mg/L)。

本次研究中，非CDV引起的呼吸道疾病組、其他原因?qū)е碌奈改c炎組、胰腺炎組、消化道寄生蟲組的CRP最高值分別為 109.07,125.96,111.60，81.37 mg/L。在這4組中均未出現(xiàn)病例死亡。

2.3 CRP與WBC變化趨勢(shì)分析

2.3.1 細(xì)小病毒組 細(xì)小病毒患犬的CRP濃度均出現(xiàn)升高，白細(xì)胞總數(shù)變化不定。有30.38%的白細(xì)胞總數(shù)低于正常范圍，8.89%的白細(xì)胞總數(shù)高于正常范圍，其余白細(xì)胞總數(shù)均在正常范圍內(nèi)。圖1中，CRP值在病程早期均處于高位，而白細(xì)胞總數(shù)不定。但是，當(dāng)犬得到有效治療后，CRP的變化快于WBC變化，變化幅度明顯大于WBC。在圖2中，死亡犬的CRP值在監(jiān)測(cè)過(guò)程中居高不下，WBC也低于正常值。

圖1 三例存活犬的CRP值和WBC變化趨勢(shì)

圖2 3例死亡犬的CRP值和WBC變化趨勢(shì)

2.3.2 犬瘟熱病毒組 感染犬瘟熱后，病程時(shí)間長(zhǎng)，疾病變化復(fù)雜，典型病例如下。在圖3的病例中， CRP持續(xù)上升，這提示了治療效果不明顯，通過(guò)改變治療方案(D10)，CRP值開(kāi)始出現(xiàn)持續(xù)下降，到第45天(D45)CRP已恢復(fù)正常，同時(shí)進(jìn)行犬瘟熱病毒復(fù)查為陰性，犬恢復(fù)良好。疾病的變化與CRP的變化趨勢(shì)相同。

2.3.3 胰腺炎組 組內(nèi)有1例病例進(jìn)行了約1個(gè)月的胰腺炎治療，在治療初期的CRP值為46.5 mg/L，但在最后一次就診時(shí)，該患犬已無(wú)明顯的臨床表現(xiàn)，但cPL檢測(cè)依然異常，WBC高于正常值，血液CRP濃度<5 mg/L。本次就診為該犬最后一次進(jìn)行檢查，幾天后回訪發(fā)現(xiàn)該犬精神食欲均良好，無(wú)其他異常表現(xiàn)。

圖3 1例犬瘟熱患犬的CRP濃度和WBC趨勢(shì)圖

3 討論

本研究所使用的北京勤邦犬C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試紙條的正常值參考范圍為CRP濃度<10 mg/L。筆者通過(guò)對(duì)于健康犬只的血液CRP濃度測(cè)定得出在健康犬中CRP值范圍為<5 mg/L～6.76 mg/L。

在病毒感染中，急性期反應(yīng)通常十分微弱[7-8]。本次研究中，細(xì)小病毒組CRP平均值與4種其他消化道疾病組相比都有極顯著升高，顯示了最為劇烈的急性期反應(yīng)，可見(jiàn)細(xì)小病毒感染時(shí)患犬易出現(xiàn)其他并發(fā)癥。既往研究也發(fā)現(xiàn)，細(xì)小病毒感染時(shí)患犬腸道被嚴(yán)重?fù)p傷，極易引起二次細(xì)菌感染，從而導(dǎo)致敗血癥的發(fā)生[7-8]。本次研究發(fā)現(xiàn)，并發(fā)的細(xì)菌感染在通過(guò)抗生素治療而得以迅速控制時(shí)，CRP值下降幅度明顯且其反應(yīng)早于WBC總數(shù)變化。所以，在細(xì)小病毒治療中，監(jiān)測(cè)日間CRP值有助于預(yù)知病情發(fā)展方向，便于調(diào)整治療方案和進(jìn)行病情轉(zhuǎn)歸的預(yù)后。

本研究中的冠狀病毒組、胰腺炎組、消化道寄生蟲組、其他原因引起的胃腸炎組間CRP值沒(méi)有顯著性差異， 可見(jiàn)單獨(dú)使用CRP不能用于區(qū)分這幾種消化道疾病的病因，但與健康對(duì)照組相比，CRP值的上升可提示炎性反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生。在冠狀病毒組中出現(xiàn)的一例死亡病例，其初診CRP值為113.68 mg/L，于就診當(dāng)天死亡，根據(jù)其表現(xiàn)推測(cè)該犬可能為冠狀病毒致命株感染或合并感染了細(xì)小病毒等其他病原。

現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)，在犬自發(fā)性急性胰腺炎時(shí)，CRP濃度會(huì)上升，且與溫和狀態(tài)相比，患有嚴(yán)重胰腺炎時(shí)(如胰腺壞死等)CRP濃度上升更高[10]。本次胰腺炎組中，通過(guò)B超判定患犬胰腺的狀態(tài)后亦發(fā)現(xiàn)，CRP值的高低與胰腺炎癥的嚴(yán)重程度有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在急性胰腺炎的恢復(fù)期，CRP恢復(fù)早于cPL，可見(jiàn)CRP的變化比cPL更快更敏感。

犬瘟熱病毒組與非CDV引起的呼吸道感染組間CRP沒(méi)有顯著性差異，但二者均高于健康對(duì)照組，這提示無(wú)論是否由CDV引起的呼吸道感染，都需要給以積極有效的治療。本次研究中，呼吸道癥狀已消失但出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀的犬瘟熱患犬，其CRP未恢復(fù)者均死亡，這提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)的破壞會(huì)導(dǎo)致CRP值無(wú)法恢復(fù)正常。這也同時(shí)提醒了臨床獸醫(yī)，對(duì)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的犬瘟熱患犬必須進(jìn)行CRP檢測(cè) ，CRP值居高不下者預(yù)后不良。

本次研究結(jié)果表明，雖然不能使用CRP進(jìn)行疾病的歸因診斷，但在臨床工作中，監(jiān)測(cè)CRP值有助于判斷多種疾病治療效果。在判斷疾病轉(zhuǎn)歸方向時(shí)，CRP濃度的變化幅度比白細(xì)胞總數(shù)更加明顯，反應(yīng)也更早發(fā)生。犬CRP的檢測(cè)為臨床獸醫(yī)對(duì)犬類疾病的診斷和治療提供了新的手段。

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