喬晴，彭新然，劉軍紅，何兵兵，李辰

（河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南鄭州450003）

汞是具有揮發(fā)性、持久富集性、毒性較大的有毒重金屬元素之一。汞的不同形態(tài)表現(xiàn)出的毒性不同，都會(huì)損害人體的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，嚴(yán)重威脅人類健康，其中有機(jī)汞中的甲基汞毒性最大。汞及其化合物廣泛存在于環(huán)境和食物鏈中，尤其是魚、貝類等人類經(jīng)常攝入的水產(chǎn)品，通過(guò)食物鏈生物放大作用，體內(nèi)富集的汞含量遠(yuǎn)超出環(huán)境中汞含量，并且主要以甲基汞形態(tài)存在[1-4]。因此，對(duì)水產(chǎn)及制品中的甲基汞檢測(cè)尤為重要。

近年來(lái)，形態(tài)分析方法的建立和改進(jìn)，已經(jīng)成為分析研究的一大趨勢(shì)。針對(duì)生物樣品分析的前處理方法有多種，而微波消解法、超聲提取法具有提取效率高、操作簡(jiǎn)便、適應(yīng)性廣等優(yōu)勢(shì)[5-6]。汞的形態(tài)分析主要有采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法，原子熒光、紫外檢測(cè)器、電感耦合等離子體質(zhì)譜的檢測(cè)手段與高效液相色譜的分離手段聯(lián)用等各種技術(shù)[7-10]。這些分析方法極大的方便了測(cè)定水產(chǎn)及制品中甲基汞和無(wú)機(jī)汞含量。

本文采用超聲輔助和微波輔助酸提取兩種方法對(duì)樣品前處理，優(yōu)化處理的條件，比較實(shí)驗(yàn)條件對(duì)提取效果的影響。然后采用液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法（high performance liquid chromatographyinductive coupled plasma emission spectrometer-mass spectrometer，HPLC-ICP-MS）和液相色譜-原子熒光聯(lián)用法（liquid chromatography-atomic fluorescence spectroscopy，LC-AFS），選擇最佳儀器條件測(cè)定水產(chǎn)及制品中的甲基汞和無(wú)機(jī)汞含量。本文通過(guò)研究有害元素汞的形態(tài)分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)及其制品中的甲基汞、無(wú)機(jī)汞含量的準(zhǔn)確檢測(cè)，將為保障我國(guó)食品安全，預(yù)防汞污染對(duì)人體的危害，應(yīng)對(duì)國(guó)外技術(shù)壁壘，提高本國(guó)產(chǎn)品的出口競(jìng)爭(zhēng)力提供參考依據(jù)，具有很強(qiáng)的應(yīng)用前景和潛在的社會(huì)效益。

1 材料與方法

1.1 儀器

MARS 5微波消解儀：CEM公司；LC-AFS 6500液相色譜原子熒光聯(lián)用儀：北京科創(chuàng)海光公司；ICP-MS 7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、HPLC 1200高效液相色譜、ICP-MS PFA霧化器、Zorbax Eclipse Plus C-18（150 mm×4.6 mm，5 μm）：美國(guó)安捷倫公司；Agela Venusil MP C-18（150 mm×4.6 mm，5 μm）：博納艾杰爾科技有限公司；XP205型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；Z300K高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)哈默公司；KANG SHIJIE PL-J60超聲波清洗機(jī)：東莞康士潔公司；0.45 μm濾膜：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Millipore超純水系統(tǒng)：法國(guó)密理博公司。

1.2 試劑

試驗(yàn)用水為符合GB/T 6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水；氫氧化鉀（優(yōu)級(jí)純）、硼氫化鉀（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；過(guò)硫酸鉀（分析純）、L-半胱氨酸鹽酸鹽（生化試劑）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氨水（分析純）：煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；乙酸銨（優(yōu)級(jí)純）、甲醇（色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；氫氧化鈉（優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（優(yōu)級(jí)純）：北京化工廠；甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（GBW 08675，63.6±2.4 μg/g）、無(wú)機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（GBW 08617，1000 μg/mL）：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。

1.3 溶液的配制

5 mol/L鹽酸：量取41.66 mL鹽酸，用水稀釋定容至100 mL。

5 mol/L鹽酸+0.10%L-半胱氨酸：稱取0.1 g L-半胱氨酸，用水溶解，緩慢加入41.66 mL鹽酸，用水稀釋定容至100 mL。

氫氧化鈉溶液（6 mol/L）：稱取24 g氫氧化鈉溶于水并稀釋至100 mL。

LC-AFS流動(dòng)相（5.0%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.10%L-半胱氨酸）：稱取0.5 g L-半胱氨酸，2.2 g乙酸銨，至于從500 mL容量瓶中，用水溶解，加入25 mL甲醇，定容500 mL。用20%氨水溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，超聲脫氣30 min。

HPLC-ICP-MS流動(dòng)相A（10 mmol/L乙酸銨，0.10%L-半胱氨酸，pH=7.5）：稱取0.771 g乙酸銨和1 g L-半胱氨酸，用水溶解，加水稀釋定容至1000 mL。用20%氨水溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，超聲脫氣30 min；流動(dòng)相B：甲醇。

甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取0.7862 g甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液，用2%甲醇稀釋定容至25 mL。

無(wú)機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取10 mL無(wú)機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)溶液，用5%鹽酸稀釋定容至100 mL，再分取2 mL用2%甲醇稀釋定容至100 mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（50 ng/mL）：準(zhǔn)確移取甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和無(wú)機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.625 mL，用2%甲醇稀釋定容至25 mL，使用時(shí)現(xiàn)配。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理

取三文魚可食部分，用搗碎機(jī)打成勻漿，混勻，均分成兩份作為試樣，分別裝入潔凈的容器內(nèi)，密封并標(biāo)明標(biāo)記。試樣應(yīng)于-18℃以下保存。

1.4.2 微波消解前處理法

稱取樣品1 g（精確到0.001 g），加入10 mL5 mol/L鹽酸，按照預(yù)先設(shè)定的條件消解，微波消解儀參數(shù)見表1。

表1 微波消解儀參數(shù)Table 1 Parameters of microwave digestion instrument

取1 mL樣液至25 mL刻度管中，緩慢逐滴加入氫氧化鈉溶液（6 mol/L）溶液，調(diào)節(jié)pH值至2～7，用水定容至10 mL，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。同時(shí)作空白試驗(yàn)。

1.4.3 超聲輔助提取前處理法

稱取樣品1 g（精確到0.001 g），置于25 mL離心管中，加入10 mL提取溶液（5 mol/L鹽酸+0.10%L-半胱氨酸），放置過(guò)夜。在20℃下超聲萃取1.5 h，期間振搖數(shù)次。于4℃下以4500 r/min離心30 min。移取4 mL上清液至25 mL刻度管中，緩慢逐滴加入氫氧化鈉溶液（6 mol/L）溶液，調(diào)節(jié)pH值至2～7，用水定容至10 mL，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。同時(shí)作空白試驗(yàn)。

1.4.4 LC-AFS法儀器條件

色譜柱：AgelaVenusilMPC-18分析柱，長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒度5 μm；流動(dòng)相：5.0%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨 +0.1%L-半胱氨酸；進(jìn)樣體積：100 μL；流速：1.4 mL/min。

載流：10%HCl；氧化劑：過(guò)硫酸鉀溶液（2 g/L）；還原劑：硼氫化鉀溶液（2 g/L）；紫外消解儀：開；負(fù)高壓：300 V；原子化器高度：10 mm；燈電流：30 mA；載氣流量：500 mL/min；屏蔽氣流量：900 mL/min；泵轉(zhuǎn)速：80 r/min。

1.4.5 HPLC-ICP-MS法儀器條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相 A ∶流動(dòng)相B=98 ∶2；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL。

射頻功率：1550 W；射頻匹配：1.80 V；載氣流量：0.44 L/min；采樣深度：8.0 mm；霧化室溫度：-5℃；積分時(shí)間：1 s；質(zhì)量數(shù)：202；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：0.30 r/s。

1.4.6 樣品測(cè)定

分別采用1.4.4和1.4.5所述儀器條件依次對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列、空白溶液和試樣溶液進(jìn)行測(cè)定，以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時(shí)間定性，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)試樣進(jìn)行定量。按步驟，對(duì)同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種樣品前處理方法的比較

樣品的前處理方法是汞的形態(tài)分析中最重要的步驟之一，關(guān)鍵是如何防止樣品污染，克服汞的吸附和揮發(fā)，避免汞及其化合物在提取過(guò)程中可能產(chǎn)生的損失[11-12]。

2.1.1 提取劑的選擇

水產(chǎn)及制品的樣品基體復(fù)雜，蛋白含量高，試驗(yàn)比較了堿消解和酸消解的提取效果，發(fā)現(xiàn)酸消解的提取效果和穩(wěn)定性更好，而堿消解提取所需時(shí)間較長(zhǎng)，在甲基汞含量較低時(shí)會(huì)存在復(fù)雜的基體效應(yīng)。因此，試驗(yàn)選用5 mol/L鹽酸作為水產(chǎn)及其制品樣品汞形態(tài)分析的提取劑。

2.1.2 微波消解前處理法條件優(yōu)化

微波消解萃取試劑污染小，重現(xiàn)性高，在微波消解過(guò)程中不會(huì)破壞碳-金屬元素鍵，適用于元素形態(tài)分析的前處理[13-15]。微波消解的溫度和消解時(shí)間對(duì)樣品中汞及化合物的提取效率均有影響。若微波消解溫度太低反應(yīng)速度慢，消解時(shí)間太長(zhǎng)。若微波消解溫度壓力過(guò)高，反應(yīng)劇烈，極易造成汞及化合物的損失。試驗(yàn)選取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 2976貽貝（甲基汞范圍28.09±0.31 μg/kg）進(jìn)行測(cè)定，加入 25 μg/kg的無(wú)機(jī)汞、甲基汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別選擇5個(gè)保持時(shí)間和5個(gè)消解溫度，通過(guò)HPLC-ICP-MS測(cè)定樣品的加標(biāo)回收率進(jìn)行微波消解條件優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 微波輔助提取的加標(biāo)回收率Table 2 Recoveries of microwave-assisted extraction

結(jié)果表明，微波消解優(yōu)化最佳條件為消解溫度為85℃，提取劑為5 mol/L鹽酸，保持時(shí)間為15 min。另外，要選擇高壓密閉的微波消解儀進(jìn)行消解提取，防止汞及化合物的損失。

2.1.3 最佳超聲提取條件的確定

目前汞的形態(tài)分析主要是通過(guò)鹽酸+L-半胱氨酸作為提取溶液[16]，L-半胱氨酸中的S與Hg結(jié)合形成金屬-半胱氨酸絡(luò)合物，并在一定的酸度下，把樣品中無(wú)機(jī)汞和甲基汞提取出來(lái)。試驗(yàn)選取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 2976貽貝進(jìn)行測(cè)定，加入25 μg/kg的無(wú)機(jī)汞、甲基汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC-ICP-MS測(cè)定不同鹽酸、L-半胱氨酸用量以及不同超聲時(shí)間的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。

表3 超聲輔助提取的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of ultrasonic-assisted extraction

結(jié)果表明，鹽酸濃度越大加標(biāo)回收率越高，但鹽酸濃度逐漸增加，中和鹽酸的堿溶液增多，會(huì)對(duì)ICP-MS檢測(cè)器有影響，綜合考慮，選取5 mol/L鹽酸+0.10%L-半胱氨酸，超聲提取1.5h作為最佳超聲提取條件。

2.2 兩種測(cè)定分析方法的比較

2.2.1 LC-AFS法操作要點(diǎn)

依據(jù)GB 5009.17-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》中第二篇食品中甲基汞的測(cè)定，選擇流動(dòng)相為5.0%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.10%L-半胱氨酸，測(cè)定5 ng/mL汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，無(wú)機(jī)汞、甲基汞的保留時(shí)間分別為1.810 min，2.592 min，結(jié)果見圖1。

圖1 LC-AFS色譜分離圖Fig.1 The separation chromatographic of LC-AFS

2.2.2 HPLC-ICP-MS法操作要點(diǎn)

試驗(yàn)選用乙酸銨為緩沖鹽來(lái)調(diào)節(jié)峰形，L-半胱氨酸作為絡(luò)合劑與各種汞形態(tài)反應(yīng)形成非極性化合物進(jìn)行分離，改變流動(dòng)相中甲醇的含量使出峰時(shí)間最佳。通過(guò)比較，選擇流動(dòng)相A（10 mmol/L乙酸銨，0.10%L-半胱氨酸，pH=7.5）：流動(dòng)相 B（甲醇）=（體積比為 98∶2），測(cè)定5 ng/mL汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，無(wú)機(jī)汞、甲基汞的保留時(shí)間分別為1.751 min，2.501 min，見圖2。

圖2 HPLC-ICP-MS色譜分離圖Fig.2 The separation chromatographic of HPLC-ICP-MS

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.2、0.4、0.8、1.2、2.0 mL 于一組 10 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，得到甲基汞和無(wú)機(jī)汞的濃度分別0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后，調(diào)節(jié)LC-AFS和HPLC-ICPMS儀器條件達(dá)到最優(yōu)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中無(wú)機(jī)汞和甲基汞的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，檢出限為3倍基線噪聲（3S/N），結(jié)果見表4。

表4 線性范圍和方法檢出限Table 4 Calibration curve and limit of detection

由表4可以看出LC-AFS和HPLC-ICP-MS兩種方法的無(wú)機(jī)汞、甲基汞在1.0 ng/mL～10 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限均可滿足檢測(cè)要求。

2.4 回收率和精密度

按照1.4.4和1.4.5中所列儀器條件，選取三文魚肉樣品，進(jìn)行不同濃度水平的加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表5。

表5 加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果Table 5 Recoveries and precisions

續(xù)表5 加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果Continue table 5 Recoveries and precisions

結(jié)果表明，4種試驗(yàn)方法測(cè)定甲基汞、無(wú)機(jī)汞加標(biāo)回收率結(jié)果可達(dá)到GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》要求，其中超聲提取-液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法的重現(xiàn)性最好。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的驗(yàn)證

采用1.4中4種試驗(yàn)方法，用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 2976貽貝（甲基汞范圍28.09±0.31 μg/kg）驗(yàn)證方法準(zhǔn)確性，結(jié)果見表6。

表6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 6 Results of standard reference materials

結(jié)果表明，4種試驗(yàn)方法甲基汞結(jié)果均在范圍以內(nèi)，超聲提取-液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法的重現(xiàn)性最好。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用超聲輔助和微波輔助酸提取兩種方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，然后用LC-AFS和HPLC-ICP-MS測(cè)定水產(chǎn)及制品中的無(wú)機(jī)汞和甲基汞含量。經(jīng)過(guò)比較，兩種前處理方法均有較高的提取率，微波輔助提取節(jié)省時(shí)間，試劑、污染??；超聲輔助萃取的操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用性更強(qiáng)。兩種測(cè)定方法的檢出限、回收率和精密度均能滿足水產(chǎn)及制品的檢測(cè)要求，LC-AFS結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易操作，分析成本低，但在LC-ICP-MS價(jià)格昂貴，操作要求高，但靈敏度高，選擇性強(qiáng)，對(duì)分析基質(zhì)復(fù)雜樣品中的甲基汞和無(wú)機(jī)汞分離效果更穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確度高。因此，超聲輔助萃取HPLC-ICP-MS法更適合測(cè)定水產(chǎn)及制品中的無(wú)機(jī)汞和甲基汞含量。

[1] 楊杰,王竹天,楊大進(jìn),等.食品中甲基汞和汞形態(tài)分析技術(shù)的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2008,35(3):181-187

[2] 張學(xué),朱建民,彭立核,等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定魚肉中的3種汞形態(tài)[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2016,26(6):803-807

[3] 尚曉虹,趙云峰,張磊,等.水產(chǎn)品中甲基汞測(cè)定的液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用方法的改進(jìn)[J].色譜,2011,29(7):667-672

[4] 歐陽(yáng)珮珮,黃誠(chéng),丘福保.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中的無(wú)機(jī)汞、甲基汞和乙基汞[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2016,26(1):50-53

[5] 曾慶文,江暉,李丹,等.利用AFS和LC-AFS測(cè)定魚肉中的總汞與甲基汞[J].分析試驗(yàn)室,2015,34(11):1259-1262

[6] 孫秀敏,雷敏,李璐,等.微波消解-ICP-MS法同時(shí)測(cè)定土壤中8種重(類)金屬元素[J].分析試驗(yàn)室,2014,33(10):1177-1180

[7] 張?zhí)m,陳玉紅,施燕支,等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定二價(jià)汞、甲基汞、乙基汞與苯基汞[J].環(huán)境化學(xué),2009,28(5):772-774

[8] 傅雄偉,李海普,楊遠(yuǎn),等.高效液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定水中的二價(jià)汞、甲基汞與乙基汞[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè),2016,52(11):1277-1281

[9] 王征,游飛明,邱秀玉,等.HPLC-ICP-MS法測(cè)定水樣中的甲基汞、乙基汞和無(wú)機(jī)汞[J].福建分析測(cè)試,2009,18(1):28-31

[10]黃先亮,屠大偉,朱永紅,等.食品安全元素形態(tài)分析聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用[J].中國(guó)調(diào)味品,2014,39(5):134-140

[11]潘曉東,湯鋆,馬冰潔,等.魚肉中甲基汞不同提取方法的比較[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2011,21(1):63-64

[12]賈彥博,陸吉琛,朱蓓,等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定東海烏參樣品中的二價(jià)汞、甲基汞、乙基汞和苯基汞[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2016,7(11):4609-4613

[13]肖亞兵,崔穎,陳文碩,等.液相色譜-原子熒光法測(cè)定魚肉中有機(jī)汞形態(tài)[J].食品研究與開發(fā),2014,35(21):106-108

[14]冷庚,王俊偉,萬(wàn)旭,等.微波輔助高效液相色譜-冷原子熒光光譜法測(cè)定沉積物中甲基汞和無(wú)機(jī)汞[J].分析化學(xué),2012,40(2):191-195

[15]梁立娜,胡敬田,江桂斌.微波輔助萃取技術(shù)在有機(jī)錫砷汞化合物形態(tài)分析中的應(yīng)用[J].巖礦測(cè)試,2003,22(2):137-150

[16]杭婧,馮曉青,胡曉抒.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定動(dòng)物源性中藥材中無(wú)機(jī)汞和甲基汞[J].分析儀器,2016(6):89-94