喬晴,彭新然,劉軍紅,何兵兵,李辰
(河南出入境檢驗(yàn)檢疫局,河南鄭州450003)
汞是具有揮發(fā)性、持久富集性、毒性較大的有毒重金屬元素之一。汞的不同形態(tài)表現(xiàn)出的毒性不同,都會(huì)損害人體的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng),嚴(yán)重威脅人類健康,其中有機(jī)汞中的甲基汞毒性最大。汞及其化合物廣泛存在于環(huán)境和食物鏈中,尤其是魚、貝類等人類經(jīng)常攝入的水產(chǎn)品,通過(guò)食物鏈生物放大作用,體內(nèi)富集的汞含量遠(yuǎn)超出環(huán)境中汞含量,并且主要以甲基汞形態(tài)存在[1-4]。因此,對(duì)水產(chǎn)及制品中的甲基汞檢測(cè)尤為重要。
近年來(lái),形態(tài)分析方法的建立和改進(jìn),已經(jīng)成為分析研究的一大趨勢(shì)。針對(duì)生物樣品分析的前處理方法有多種,而微波消解法、超聲提取法具有提取效率高、操作簡(jiǎn)便、適應(yīng)性廣等優(yōu)勢(shì)[5-6]。汞的形態(tài)分析主要有采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,原子熒光、紫外檢測(cè)器、電感耦合等離子體質(zhì)譜的檢測(cè)手段與高效液相色譜的分離手段聯(lián)用等各種技術(shù)[7-10]。這些分析方法極大的方便了測(cè)定水產(chǎn)及制品中甲基汞和無(wú)機(jī)汞含量。
本文采用超聲輔助和微波輔助酸提取兩種方法對(duì)樣品前處理,優(yōu)化處理的條件,比較實(shí)驗(yàn)條件對(duì)提取效果的影響。然后采用液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法(high performance liquid chromatographyinductive coupled plasma emission spectrometer-mass spectrometer,HPLC-ICP-MS)和液相色譜-原子熒光聯(lián)用法(liquid chromatography-atomic fluorescence spectroscopy,LC-AFS),選擇最佳儀器條件測(cè)定水產(chǎn)及制品中的甲基汞和無(wú)機(jī)汞含量。本文通過(guò)研究有害元素汞的形態(tài)分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)及其制品中的甲基汞、無(wú)機(jī)汞含量的準(zhǔn)確檢測(cè),將為保障我國(guó)食品安全,預(yù)防汞污染對(duì)人體的危害,應(yīng)對(duì)國(guó)外技術(shù)壁壘,提高本國(guó)產(chǎn)品的出口競(jìng)爭(zhēng)力提供參考依據(jù),具有很強(qiáng)的應(yīng)用前景和潛在的社會(huì)效益。
MARS 5微波消解儀:CEM公司;LC-AFS 6500液相色譜原子熒光聯(lián)用儀:北京科創(chuàng)海光公司;ICP-MS 7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、HPLC 1200高效液相色譜、ICP-MS PFA霧化器、Zorbax Eclipse Plus C-18(150 mm×4.6 mm,5 μm):美國(guó)安捷倫公司;Agela Venusil MP C-18(150 mm×4.6 mm,5 μm):博納艾杰爾科技有限公司;XP205型電子天平:瑞士梅特勒-托利多公司;Z300K高速冷凍離心機(jī):德國(guó)哈默公司;KANG SHIJIE PL-J60超聲波清洗機(jī):東莞康士潔公司;0.45 μm濾膜:天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Millipore超純水系統(tǒng):法國(guó)密理博公司。
試驗(yàn)用水為符合GB/T 6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水;氫氧化鉀(優(yōu)級(jí)純)、硼氫化鉀(分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;過(guò)硫酸鉀(分析純)、L-半胱氨酸鹽酸鹽(生化試劑):天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;氨水(分析純):煙臺(tái)市雙雙化工有限公司;乙酸銨(優(yōu)級(jí)純)、甲醇(色譜純):賽默飛世爾科技有限公司;氫氧化鈉(優(yōu)級(jí)純):國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司;鹽酸(優(yōu)級(jí)純):北京化工廠;甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW 08675,63.6±2.4 μg/g)、無(wú)機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW 08617,1000 μg/mL):國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。
5 mol/L鹽酸:量取41.66 mL鹽酸,用水稀釋定容至100 mL。
5 mol/L鹽酸+0.10%L-半胱氨酸:稱取0.1 g L-半胱氨酸,用水溶解,緩慢加入41.66 mL鹽酸,用水稀釋定容至100 mL。
氫氧化鈉溶液(6 mol/L):稱取24 g氫氧化鈉溶于水并稀釋至100 mL。
LC-AFS流動(dòng)相(5.0%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.10%L-半胱氨酸):稱取0.5 g L-半胱氨酸,2.2 g乙酸銨,至于從500 mL容量瓶中,用水溶解,加入25 mL甲醇,定容500 mL。用20%氨水溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾,超聲脫氣30 min。
HPLC-ICP-MS流動(dòng)相A(10 mmol/L乙酸銨,0.10%L-半胱氨酸,pH=7.5):稱取0.771 g乙酸銨和1 g L-半胱氨酸,用水溶解,加水稀釋定容至1000 mL。用20%氨水溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾,超聲脫氣30 min;流動(dòng)相B:甲醇。
甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2 μg/mL):準(zhǔn)確稱取0.7862 g甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液,用2%甲醇稀釋定容至25 mL。
無(wú)機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2 μg/mL):準(zhǔn)確稱取10 mL無(wú)機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)溶液,用5%鹽酸稀釋定容至100 mL,再分取2 mL用2%甲醇稀釋定容至100 mL。
混合標(biāo)準(zhǔn)使用液(50 ng/mL):準(zhǔn)確移取甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和無(wú)機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.625 mL,用2%甲醇稀釋定容至25 mL,使用時(shí)現(xiàn)配。
取三文魚可食部分,用搗碎機(jī)打成勻漿,混勻,均分成兩份作為試樣,分別裝入潔凈的容器內(nèi),密封并標(biāo)明標(biāo)記。試樣應(yīng)于-18℃以下保存。
稱取樣品1 g(精確到0.001 g),加入10 mL5 mol/L鹽酸,按照預(yù)先設(shè)定的條件消解,微波消解儀參數(shù)見表1。
表1 微波消解儀參數(shù)Table 1 Parameters of microwave digestion instrument
取1 mL樣液至25 mL刻度管中,緩慢逐滴加入氫氧化鈉溶液(6 mol/L)溶液,調(diào)節(jié)pH值至2~7,用水定容至10 mL,用0.45 μm濾膜過(guò)濾,待測(cè)。同時(shí)作空白試驗(yàn)。
稱取樣品1 g(精確到0.001 g),置于25 mL離心管中,加入10 mL提取溶液(5 mol/L鹽酸+0.10%L-半胱氨酸),放置過(guò)夜。在20℃下超聲萃取1.5 h,期間振搖數(shù)次。于4℃下以4500 r/min離心30 min。移取4 mL上清液至25 mL刻度管中,緩慢逐滴加入氫氧化鈉溶液(6 mol/L)溶液,調(diào)節(jié)pH值至2~7,用水定容至10 mL,用0.45 μm濾膜過(guò)濾,待測(cè)。同時(shí)作空白試驗(yàn)。
色譜柱:AgelaVenusilMPC-18分析柱,長(zhǎng)150mm,內(nèi)徑4.6 mm,粒度5 μm;流動(dòng)相:5.0%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨 +0.1%L-半胱氨酸;進(jìn)樣體積:100 μL;流速:1.4 mL/min。
載流:10%HCl;氧化劑:過(guò)硫酸鉀溶液(2 g/L);還原劑:硼氫化鉀溶液(2 g/L);紫外消解儀:開;負(fù)高壓:300 V;原子化器高度:10 mm;燈電流:30 mA;載氣流量:500 mL/min;屏蔽氣流量:900 mL/min;泵轉(zhuǎn)速:80 r/min。
色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相:流動(dòng)相 A ∶流動(dòng)相B=98 ∶2;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:50 μL。
射頻功率:1550 W;射頻匹配:1.80 V;載氣流量:0.44 L/min;采樣深度:8.0 mm;霧化室溫度:-5℃;積分時(shí)間:1 s;質(zhì)量數(shù):202;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速:0.30 r/s。
分別采用1.4.4和1.4.5所述儀器條件依次對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列、空白溶液和試樣溶液進(jìn)行測(cè)定,以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時(shí)間定性,用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)試樣進(jìn)行定量。按步驟,對(duì)同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定。
樣品的前處理方法是汞的形態(tài)分析中最重要的步驟之一,關(guān)鍵是如何防止樣品污染,克服汞的吸附和揮發(fā),避免汞及其化合物在提取過(guò)程中可能產(chǎn)生的損失[11-12]。
水產(chǎn)及制品的樣品基體復(fù)雜,蛋白含量高,試驗(yàn)比較了堿消解和酸消解的提取效果,發(fā)現(xiàn)酸消解的提取效果和穩(wěn)定性更好,而堿消解提取所需時(shí)間較長(zhǎng),在甲基汞含量較低時(shí)會(huì)存在復(fù)雜的基體效應(yīng)。因此,試驗(yàn)選用5 mol/L鹽酸作為水產(chǎn)及其制品樣品汞形態(tài)分析的提取劑。
微波消解萃取試劑污染小,重現(xiàn)性高,在微波消解過(guò)程中不會(huì)破壞碳-金屬元素鍵,適用于元素形態(tài)分析的前處理[13-15]。微波消解的溫度和消解時(shí)間對(duì)樣品中汞及化合物的提取效率均有影響。若微波消解溫度太低反應(yīng)速度慢,消解時(shí)間太長(zhǎng)。若微波消解溫度壓力過(guò)高,反應(yīng)劇烈,極易造成汞及化合物的損失。試驗(yàn)選取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 2976貽貝(甲基汞范圍28.09±0.31 μg/kg)進(jìn)行測(cè)定,加入 25 μg/kg的無(wú)機(jī)汞、甲基汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別選擇5個(gè)保持時(shí)間和5個(gè)消解溫度,通過(guò)HPLC-ICP-MS測(cè)定樣品的加標(biāo)回收率進(jìn)行微波消解條件優(yōu)化,結(jié)果見表2。
表2 微波輔助提取的加標(biāo)回收率Table 2 Recoveries of microwave-assisted extraction
結(jié)果表明,微波消解優(yōu)化最佳條件為消解溫度為85℃,提取劑為5 mol/L鹽酸,保持時(shí)間為15 min。另外,要選擇高壓密閉的微波消解儀進(jìn)行消解提取,防止汞及化合物的損失。
目前汞的形態(tài)分析主要是通過(guò)鹽酸+L-半胱氨酸作為提取溶液[16],L-半胱氨酸中的S與Hg結(jié)合形成金屬-半胱氨酸絡(luò)合物,并在一定的酸度下,把樣品中無(wú)機(jī)汞和甲基汞提取出來(lái)。試驗(yàn)選取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 2976貽貝進(jìn)行測(cè)定,加入25 μg/kg的無(wú)機(jī)汞、甲基汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,HPLC-ICP-MS測(cè)定不同鹽酸、L-半胱氨酸用量以及不同超聲時(shí)間的加標(biāo)回收率,結(jié)果見表3。
表3 超聲輔助提取的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of ultrasonic-assisted extraction
結(jié)果表明,鹽酸濃度越大加標(biāo)回收率越高,但鹽酸濃度逐漸增加,中和鹽酸的堿溶液增多,會(huì)對(duì)ICP-MS檢測(cè)器有影響,綜合考慮,選取5 mol/L鹽酸+0.10%L-半胱氨酸,超聲提取1.5h作為最佳超聲提取條件。
依據(jù)GB 5009.17-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》中第二篇食品中甲基汞的測(cè)定,選擇流動(dòng)相為5.0%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.10%L-半胱氨酸,測(cè)定5 ng/mL汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,無(wú)機(jī)汞、甲基汞的保留時(shí)間分別為1.810 min,2.592 min,結(jié)果見圖1。
圖1 LC-AFS色譜分離圖Fig.1 The separation chromatographic of LC-AFS
試驗(yàn)選用乙酸銨為緩沖鹽來(lái)調(diào)節(jié)峰形,L-半胱氨酸作為絡(luò)合劑與各種汞形態(tài)反應(yīng)形成非極性化合物進(jìn)行分離,改變流動(dòng)相中甲醇的含量使出峰時(shí)間最佳。通過(guò)比較,選擇流動(dòng)相A(10 mmol/L乙酸銨,0.10%L-半胱氨酸,pH=7.5):流動(dòng)相 B(甲醇)=(體積比為 98∶2),測(cè)定5 ng/mL汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,無(wú)機(jī)汞、甲基汞的保留時(shí)間分別為1.751 min,2.501 min,見圖2。
圖2 HPLC-ICP-MS色譜分離圖Fig.2 The separation chromatographic of HPLC-ICP-MS
混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.2、0.4、0.8、1.2、2.0 mL 于一組 10 mL 容量瓶中,用流動(dòng)相定容至刻度,得到甲基汞和無(wú)機(jī)汞的濃度分別0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后,調(diào)節(jié)LC-AFS和HPLC-ICPMS儀器條件達(dá)到最優(yōu),以色譜峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液中無(wú)機(jī)汞和甲基汞的濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù),檢出限為3倍基線噪聲(3S/N),結(jié)果見表4。
表4 線性范圍和方法檢出限Table 4 Calibration curve and limit of detection
由表4可以看出LC-AFS和HPLC-ICP-MS兩種方法的無(wú)機(jī)汞、甲基汞在1.0 ng/mL~10 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢出限均可滿足檢測(cè)要求。
按照1.4.4和1.4.5中所列儀器條件,選取三文魚肉樣品,進(jìn)行不同濃度水平的加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表5。
表5 加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果Table 5 Recoveries and precisions
續(xù)表5 加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果Continue table 5 Recoveries and precisions
結(jié)果表明,4種試驗(yàn)方法測(cè)定甲基汞、無(wú)機(jī)汞加標(biāo)回收率結(jié)果可達(dá)到GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》要求,其中超聲提取-液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法的重現(xiàn)性最好。
采用1.4中4種試驗(yàn)方法,用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 2976貽貝(甲基汞范圍28.09±0.31 μg/kg)驗(yàn)證方法準(zhǔn)確性,結(jié)果見表6。
表6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 6 Results of standard reference materials
結(jié)果表明,4種試驗(yàn)方法甲基汞結(jié)果均在范圍以內(nèi),超聲提取-液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法的重現(xiàn)性最好。
試驗(yàn)采用超聲輔助和微波輔助酸提取兩種方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理,然后用LC-AFS和HPLC-ICP-MS測(cè)定水產(chǎn)及制品中的無(wú)機(jī)汞和甲基汞含量。經(jīng)過(guò)比較,兩種前處理方法均有較高的提取率,微波輔助提取節(jié)省時(shí)間,試劑、污染??;超聲輔助萃取的操作簡(jiǎn)單,應(yīng)用性更強(qiáng)。兩種測(cè)定方法的檢出限、回收率和精密度均能滿足水產(chǎn)及制品的檢測(cè)要求,LC-AFS結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,易操作,分析成本低,但在LC-ICP-MS價(jià)格昂貴,操作要求高,但靈敏度高,選擇性強(qiáng),對(duì)分析基質(zhì)復(fù)雜樣品中的甲基汞和無(wú)機(jī)汞分離效果更穩(wěn)定可靠,準(zhǔn)確度高。因此,超聲輔助萃取HPLC-ICP-MS法更適合測(cè)定水產(chǎn)及制品中的無(wú)機(jī)汞和甲基汞含量。
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