馬澤剛，黃春花，鐘輝云，吳秀麗，周禮仕，劉卓

（1.四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，四川自貢643000；2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621000）

絞股藍(lán) Gynostemma pentaphyllum（Thunb）Makino系葫蘆科Cucurbitaceae絞股藍(lán)屬Gynostemma多年生草質(zhì)藤本植物[1]?！吨兴幋筠o典》名七葉膽，別名小苦藥、遍地生根、五葉參，日本名甘茶蔓等[2-4]。該屬植物基源復(fù)雜、品種繁多，我國有14種和3變種[5]，廣泛分布于陜西、四川、湖北、福建、云南等地。絞股藍(lán)中含有皂苷、多糖、黃酮類等化合物及鐵、鋅、銅、錳、硒等20多種微量元素[6]。絞股藍(lán)皂苷具有達(dá)瑪烷型的三萜骨架，與人參皂苷結(jié)構(gòu)類似，是目前研究唯一在五加科植物以外被發(fā)現(xiàn)含有人參皂苷類成分的植物[7]。故而有“南方人參”、“第二人參”的美譽(yù)[8-10]。迄今為止，從絞股藍(lán)分離和鑒定的化物中，共有8種皂苷為人參皂苷，分別為Ginsenoside Rb1、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3、malonyl-Rd、Rf[7]。人參皂苷Rb1具有多種藥理活性，是一種具有顯著藥用價(jià)值的化學(xué)物質(zhì)。它對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的作用，具有促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力，增強(qiáng)認(rèn)知能力等促智作用[11]，同時(shí)對(duì)腦缺血損傷[12]和神經(jīng)損傷[13]有一定保護(hù)作用。人參皂苷Rb1對(duì)心血管系統(tǒng)也有作用，有研究表明它對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡有抑制作用[14]，可以對(duì)抗同型半胱氨酸引起的血管內(nèi)膜增生，減弱其引起的血管內(nèi)膜增生的程度[15]。同時(shí)人參皂苷Rb1可以抗腫瘤[16]，降血糖[17]，對(duì)于免疫系統(tǒng)[18]的調(diào)節(jié)也有一定的重要作用。人參皂苷Rb3在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)也有一定的的作用。有研究表明，人參皂苷Rb3可以保護(hù)缺血時(shí)心肌功能、抑制血管平滑肌細(xì)胞增生[19]。對(duì)血液系統(tǒng)的作用，人參皂苷Rb3主要表現(xiàn)在抑制血小板活化聚集，防止血栓的形成[20]。人參皂苷Rd藥理顯著，除有與其他人參皂苷類似的作用外[21]，還具有抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤抗炎[21-22]等獨(dú)特的藥理作用。文獻(xiàn)報(bào)道，人參皂苷Rc對(duì)抗腫瘤、治療心腦血管疾病方面也有良好的表現(xiàn)[23]。

絞股藍(lán)皂苷是絞股藍(lán)的顯著藥效成分[24-25]，藥用效果與人參皂苷相似[26]，國內(nèi)外均有研究證明絞股藍(lán)皂苷具有明顯的抗腫瘤，降血脂，抗疲勞，保肝等作用[27]。由于絞股藍(lán)產(chǎn)地較多，各地品質(zhì)差異性較大，故絞股藍(lán)皂苷成分含量的準(zhǔn)確定量是開發(fā)絞股藍(lán)優(yōu)質(zhì)資源的必要條件。目前文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于絞股藍(lán)皂苷含量的分析方法較多，但采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）同時(shí)測(cè)定絞股藍(lán)藥材中人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd的研究較少，而這4種人參皂苷也是絞股藍(lán)中藥理活性比較高的成分。本文采用HPLC法同時(shí)測(cè)定了陜西、湖北、江西、內(nèi)蒙、廣東、福建、云南和四川8個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)藥材中人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd這4種皂苷的含量，為絞股藍(lán)的質(zhì)量控制和深入研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍(lán)藥材（分別來自陜西、湖北、江西、內(nèi)蒙、廣東、福建、云南和四川）經(jīng)四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院副主任藥師鐘輝云鑒定為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)[Gynostemma pentaphyllum（Thunb）Makino]；對(duì)照品 Rb1、Rb3、Rc、Rd：成都瑞芬思生物科技公司，經(jīng)HPLC面積歸一化法測(cè)定，純度為＞98%。乙腈、甲醇（均為色譜純）：美國Sigma試劑公司；乙醇、正丁醇、氯仿（均為國產(chǎn)分析純）：成都市科龍化工試劑廠；水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200B型超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-5286A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；AE240電子天平：瑞士Metter Toledo公司；高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜條件

美國SunFireTM-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-水；梯度洗脫，時(shí)間程序?yàn)?～10 min～15 min～25 min～30 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)相應(yīng)為30%～35%～40%～50%～60%；流速為0.8 mL/min；柱溫為25℃；檢測(cè)波長203 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc、人參皂苷 Rd 對(duì)照品 3.0、2.0、3.0、1.0 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，充分搖勻，制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.3 供試品溶液制備

根據(jù)本試驗(yàn)前期的研究，得出絞股藍(lán)總皂苷最佳的提取工藝，即取1.0 g干燥的絞股藍(lán)粗粉，在60℃條件下，60%乙醇回流提取4次，每次2 h，料液比為1∶10（g/mL）。故準(zhǔn)確稱取8個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)粗粉各1.0 g，分別置于圓底燒瓶中，加入10 mL 60%乙醇溶液，在60℃條件下，回流提取4次，每次2 h。合并提取液，過濾，將濾液蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，浸膏用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系考察

準(zhǔn)確吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)量20 μL，確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間，然后將對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至4、8、16、32、64倍，振蕩均勻，作為對(duì)照品稀釋液。按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)量20 μL，平行測(cè)定3次，以平均峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。各物質(zhì)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表1。

人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd這4種成分在線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。對(duì)照品色譜圖見圖1。

表1 對(duì)照品的線性關(guān)系（n=4）Table 1 Regression equations of reference substances（n=4）

圖1 對(duì)照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances

2.2 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取混合對(duì)照品溶液10μL，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各自的峰面積，并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值。結(jié)果人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd峰面積的RSD值分別為0.56%、0.34%、0.61%、0.89%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取江西絞股藍(lán)1.0 g，按“1.3.3”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、6、8、12、16、20、24 h 測(cè)定各成分的峰面積。結(jié)果人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd峰面積的RSD 分別為 0.23%、0.64%、0.31%、0.74%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取江西絞股藍(lán)6份，按“1.3.3”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果人參皂苷 Rb1、Rb3、Rc、Rd 含量的 RSD 值分別為1.32%、0.98%、1.53%、1.67%，表明該方法重復(fù)性好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

取江西絞股藍(lán)5份，每份1.0 g，準(zhǔn)確稱定，并分別準(zhǔn)確加入各對(duì)照品，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd的加入量分別為0.088、11.759、0.234、1.373 mg。按“1.3.3”項(xiàng)下制備供試溶液后，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd的平均加樣回收率（n=5）分別為：99.0%、99.3%、99.2%、99.5%；RSD分別為1.51%、1.23%、1.06%、1.46%，表明該方法具有良好的回收率。

2.6 樣品的測(cè)定

根據(jù)本試驗(yàn)前期研究，得出絞股藍(lán)總皂苷最佳提取工藝，即取1.0 g不同產(chǎn)地干燥的絞股藍(lán)粗粉，在60℃條件下，60%乙醇回流提取4次，每次2 h，料液比為1∶10（g/mL），根據(jù)最佳工藝提取絞股藍(lán)，可以最大化利用其價(jià)值，并根據(jù)該工藝，按“1.3.3”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液。準(zhǔn)確吸取不同產(chǎn)地絞股藍(lán)供試品溶液20 μL，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，并用外標(biāo)法計(jì)算樣品中人參皂苷 Rb1、Rb3、Rc、Rd 的量，結(jié)果見表2。

表2 8個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)藥材中4種人參皂苷類成分的含量測(cè)定結(jié)果Table 2 The determination results of the four saponins in 8 samples from different producing areas

采用HPLC法對(duì)來自陜西、云南、四川等8個(gè)不同產(chǎn)地的絞股藍(lán)藥材中人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd的含量進(jìn)行測(cè)定，見表2。

結(jié)果表明內(nèi)蒙古產(chǎn)的絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1含量最大，江西產(chǎn)的絞股藍(lán)中人參皂苷Rb3含量最大，湖北產(chǎn)的絞股藍(lán)中人參皂苷Rc含量最大，江西產(chǎn)的絞股藍(lán)中人參皂苷Rd含量最大。除湖北、四川的絞股藍(lán)以外，其他產(chǎn)地的絞股藍(lán)中人參皂苷Rb3的含量大于人參皂苷Rb1。福建產(chǎn)的絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1、內(nèi)蒙古產(chǎn)的絞股藍(lán)中人參皂苷Rc和四川產(chǎn)的絞股藍(lán)中人參皂苷Rd含量未檢測(cè)出。不同產(chǎn)地的絞股藍(lán)人參皂苷成分在組成和含量上存在一定的差異，這可能是由于生長環(huán)境的不同造成的。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)絞股藍(lán)人參皂苷成分及含量的深入研究提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)所采用的HPLC法對(duì)8個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)中4種人參皂苷類成分的含量進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該試驗(yàn)準(zhǔn)確度回收率較高，操作可行，是一種檢測(cè)絞股藍(lán)中人參皂苷含量的有效方法。研究結(jié)果表明不同產(chǎn)地的絞股藍(lán)人參皂苷成分在組成和含量上存在一定的差異，綜合考慮，廣東和江西產(chǎn)的絞股藍(lán)中4種人參皂苷在成分和含量上都較為占優(yōu)勢(shì)。所以有必要對(duì)該地區(qū)產(chǎn)的絞股藍(lán)種植進(jìn)行規(guī)范化處理，完善質(zhì)量監(jiān)管機(jī)制。

本試驗(yàn)在前期研究中，已經(jīng)摸索出絞股藍(lán)總皂苷的最佳提取工藝，根據(jù)該工藝對(duì)不同產(chǎn)地的絞股藍(lán)進(jìn)行提取，可以充分利用其價(jià)值，進(jìn)而對(duì)人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd的含量進(jìn)行測(cè)定，其測(cè)定結(jié)果可靠。在測(cè)定各不同產(chǎn)地絞股藍(lán)4種人參皂苷中，只有福建產(chǎn)的絞股藍(lán)人參皂苷Rb1、內(nèi)蒙古產(chǎn)的絞股藍(lán)人參皂苷Rc和四川產(chǎn)的絞股藍(lán)人參皂苷Rd含量未檢測(cè)出，可能是由于這3種產(chǎn)地的絞股藍(lán)中人參皂苷Rb1、Rc和Rd含量極低，導(dǎo)致幾乎沒有紫外吸收，使紫外檢測(cè)器對(duì)其不能起到檢測(cè)作用。該試驗(yàn)中絕大部分產(chǎn)地的絞股藍(lán)中人參皂苷Rb3的含量高于人參皂苷Rb1，可見除人參皂苷Rb1外，人參皂苷Rb3也可作為絞股藍(lán)皂苷含量測(cè)定的對(duì)照品。截至目前，絞股藍(lán)尚未被《中國藥典》收錄，這可能是由于對(duì)于絞股藍(lán)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理、活性大小與結(jié)構(gòu)和構(gòu)象之間的關(guān)系還不明確。同時(shí)，由于絞股藍(lán)產(chǎn)地廣泛，成分和含量上差異顯著，導(dǎo)致各地質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，所以亟待建立可靠的絞股藍(lán)質(zhì)量評(píng)估體系。本試驗(yàn)采用的HPLC法對(duì)8個(gè)不同產(chǎn)地絞股藍(lán)中4種人參皂苷成分含量進(jìn)行測(cè)定，為絞股藍(lán)質(zhì)量控制評(píng)價(jià)體系，以及后續(xù)的研究提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。

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