（南陽(yáng)理工學(xué)院生化學(xué)院，河南南陽(yáng)473004）

艾草（Artemisia argyi），又名香艾、艾蒿，為菊科蒿屬多年生草本植物，廣泛分布于北半球的溫帶地區(qū)，少數(shù)分布于非洲、中美洲及南亞等熱帶地區(qū)，在我國(guó)主要分布于湖北、湖南、河南、安徽、山東、河北等地[1-2]。其莖、葉有獨(dú)特香味[3]，藥食兼用[4]，經(jīng)加工可制成具有保健功效和藥用價(jià)值的功能食品[5-8]。艾草中主要含有精油、生物堿、多糖、黃酮等生物活性成分[9-11]。其中的生物堿類化合物是一種重要的中草藥有效成分，有顯著的抗腫瘤、抗菌、抗過(guò)敏、抗心律失常、抗炎癥等藥理活性，具有重要的藥用價(jià)值[12-17]。

艾草生物堿的提取具有影響因素較多、高度非線性的特征。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有強(qiáng)有力的非線性處理能力，可有效表明具有非線性關(guān)系的輸入量與輸出量的關(guān)聯(lián)性，但在實(shí)際應(yīng)用中存在網(wǎng)絡(luò)全局搜索能力不足、易陷入局部最優(yōu)等缺陷[18-20]。遺傳算法是借鑒生物界自然選擇和群體進(jìn)化機(jī)制形成一種全局尋優(yōu)算法，能優(yōu)化BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的連接權(quán)值，可很好地克服BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)陷入局部最優(yōu)的缺陷，求出形式未知函數(shù)的最優(yōu)解[21-23]。

在單因素試驗(yàn)及析因試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定對(duì)艾草生物堿得率影響顯著的因素，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響顯著的因素進(jìn)行優(yōu)化，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，通過(guò)仿真訓(xùn)練后自尋優(yōu)，確定最優(yōu)的艾草生物堿提取工藝參數(shù)，以期為艾草生物堿的提取及生理活性研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 原料

艾草：南陽(yáng)市張仲景大藥房，粉碎，過(guò)篩，備用。

1.2 試劑

鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；鹽酸、硫酸、乙醇（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

BS-210S電子天平：北京塞多利斯天平有限公司；101A-2電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海中光儀器儀表有限公司；HHS-6電熱恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州杜甫儀器廠；SHA-C恒溫振蕩器：常州國(guó)華電器有限公司；UV-l100可見光分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

2 方法

2.1 艾草生物堿提取流程

艾草→粉碎→過(guò)篩→浸提→離心→過(guò)濾→低溫風(fēng)干→艾草生物堿粗品

2.2 艾草生物堿的檢測(cè)

艾草生物堿屬喹啉類化合物，在350 nm處有穩(wěn)定吸收峰，檢測(cè)時(shí)可先利用鹽酸小檗堿作為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，提取液經(jīng)離心后取上清液測(cè)其在350 nm波長(zhǎng)下的吸光值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)照，確定提取液中生物堿的濃度，進(jìn)而計(jì)算生物堿得率[14]。

2.3 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取102℃干燥至恒重的鹽酸小檗堿對(duì)照品2.81 mg，于50 mL容量瓶中以蒸餾水搖勻定容，得濃度為0.0562 mg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。分別吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液 0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 mL 于 10 mL 量瓶中，以 0.05 mol/L 的硫酸定容，350 nm測(cè)吸光度值，以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[24]。

2.4 單因素試驗(yàn)

分別稱取2.0 g經(jīng)預(yù)處理的艾草原料，根據(jù)影響艾草生物堿得率的因素，選擇料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間等因素作為考查因素，單因素試驗(yàn)時(shí)，每次固定其中3個(gè)因素，考查另一因素對(duì)艾草生物堿得率的影響。

2.5 析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Plaekett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選對(duì)艾草生物堿得率影響顯著的因素。Plaekett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平如表1所示。

表1 Plaekett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平表Table 1 Factor and level of Plaekett-Burman experiment design

2.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由析因試驗(yàn)結(jié)果可知提取溫度對(duì)艾草生物堿得率影響不顯著，故確定提取溫度為65℃，選取料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間為自變量，以艾草生物堿得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平表Table 2 Factor and level of Box-Behnken experiment design

2.7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立

以Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果中艾草生物堿得率的數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)樣本，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)的因素?cái)?shù)和待優(yōu)化的指標(biāo)數(shù)設(shè)計(jì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，選擇收斂精度10-4，建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[25-26]。

2.8 遺傳算法優(yōu)化

利用遺傳算法對(duì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行全局尋優(yōu)，以神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出值作為求解的目標(biāo)函數(shù)值，以Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)作為初始種群，種群規(guī)模15，交叉概率0.1，變異概率0.1[27-28]。

2.9 艾草生物堿得率的計(jì)算

其中：Y為艾草生物堿得率，mg/g；a為提取液吸光度；v為提取液體積，mL；m為原料質(zhì)量，g。

3 結(jié)果與分析

3.1 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果見圖1。

圖1 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of berberine hydrochloride

以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.0653x+0.0856，R2=0.998（n=10）。

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 料液比對(duì)艾草生物堿得率的影響

料液比對(duì)艾草生物堿得率的影響見圖2。

圖2 料液比對(duì)艾草生物堿得率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on yield of Artemisia argyi alkaloids

由圖2可知，隨著料液比的增大，生物堿得率逐漸升高，當(dāng)料液比大于1∶40（g/mL）時(shí)，隨料液比的增大，生物堿得率增加緩慢。可能是料液比達(dá)到一定比例時(shí)，提取體系處于動(dòng)態(tài)平衡，再增大料液比生物堿得率增加不明顯。

3.2.2 乙醇濃度對(duì)艾草生物堿得率的影響

乙醇濃度對(duì)艾草生物堿得率的影響見圖3。

由圖3可知，當(dāng)乙醇濃度小于70%時(shí)，隨乙醇濃度的增加，艾草生物堿得率逐漸增大，乙醇濃度大于70%，隨乙醇濃度增加，艾草生物堿得率呈下降趨勢(shì)。

圖3 乙醇濃度對(duì)艾草生物堿得率的影響Fig.3 The effect of ethanol concentration on yield of Artemisia argyi alkaloids

3.2.3 提取溫度對(duì)艾草生物堿得率的影響

提取溫度對(duì)艾草生物堿得率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對(duì)艾草生物堿得率的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on yield of Artemisia argyi alkaloids

由圖4可知，在65℃～75℃，隨著提取溫度升高，艾草生物堿的得率逐漸增加，當(dāng)溫度超過(guò)75℃，艾草生物堿的得率呈下降趨勢(shì)，可能是溫度過(guò)高使生物堿部分降解或異構(gòu)化，導(dǎo)致得率降低。

3.2.4 提取時(shí)間對(duì)艾草生物堿得率的影響

提取時(shí)間對(duì)艾草生物堿得率的影響見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)艾草生物堿得率的影響Fig.5 The effect of extraction time on yield of Artemisia argyi alkaloids

由圖5可知，隨提取時(shí)間的增加，艾草生物堿得率逐漸提高，提取時(shí)間大于100 min時(shí)，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，生物堿得率趨于穩(wěn)定。這可能達(dá)到一定提取時(shí)間，生物堿已充分溶出，再增大提取時(shí)間對(duì)生物堿得率影響不大。

3.3 析因試驗(yàn)及結(jié)果

析因試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 析因試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of factorial experiment

表4 方差分析表Table 4 The analysis of variance table

從方差分析表中可以看出，料液比、乙醇濃度和提取時(shí)間為顯著性因子，提取溫度對(duì)艾草生物堿的影響不顯著，故選擇料液比、乙醇濃度和提取時(shí)間作為響應(yīng)面分析試驗(yàn)的考察因素，以確定這些因素的最優(yōu)水平。根據(jù)效應(yīng)分析的原則，選擇提取溫度為65℃進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。

3.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立

Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of Box-Behnken experiment

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)的結(jié)果，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立Box-Behnken試驗(yàn)的數(shù)學(xué)模型，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)及訓(xùn)練過(guò)程如圖6所示。

圖6 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練過(guò)程Fig.6 The training process of BP neural network

由圖6知，隨訓(xùn)練次數(shù)增多，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練誤差平方和逐漸減小，經(jīng)15512次訓(xùn)練，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)收斂，收斂精度達(dá)10-4。

3.5 遺傳算法優(yōu)化結(jié)果

遺傳算法尋優(yōu)過(guò)程見圖7。

經(jīng)過(guò)200代遺傳進(jìn)化，遺傳算法預(yù)測(cè)的最佳參數(shù)為：料液比1∶46.5830（g/mL），乙醇濃度50.0065%，提取時(shí)間85.2250 min；艾草生物堿得率為0.3859 mg/g。為便于實(shí)際操作，將遺傳算法預(yù)測(cè)的最佳工藝參數(shù)修正為：料液比1∶47（g/mL），乙醇濃度 50%，提取時(shí)間85 min。

圖7 遺傳算法尋優(yōu)過(guò)程Fig.7 The optimizing computation process of genetic algorithm

3.6 最優(yōu)提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)單因素及析因試驗(yàn)結(jié)果，并與遺傳算法理論預(yù)測(cè)修正后的提取條件相結(jié)合，確定艾草生物堿最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：料液比1∶47（g/mL），乙醇濃度50%，提取時(shí)間85 min，提取溫度65℃，根據(jù)此條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)取平均值，結(jié)果為0.3827 mg/g。

4 結(jié)論

1）利用Box-Behnken試驗(yàn)中的因素水平及待優(yōu)化的試驗(yàn)指標(biāo)數(shù)設(shè)計(jì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，利用Box-Behnken試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間與艾草生物堿得率之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，經(jīng)15512次學(xué)習(xí)訓(xùn)練，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型收斂，收斂精度達(dá)10-4，說(shuō)明所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型逼近能力較強(qiáng)，可將此模型應(yīng)用于這3個(gè)提取工藝參數(shù)的優(yōu)化。

2）結(jié)合單因素、析因試驗(yàn)結(jié)果，并與遺傳算法預(yù)測(cè)修正后的提取參數(shù)相結(jié)合，得到艾草生物堿最優(yōu)的提取工藝參數(shù)為：料液比1∶47（g/mL），乙醇濃度50%，提取時(shí)間85 min，提取溫度65℃。在此條件下，艾草生物堿得率可達(dá)0.3827 mg/g。

3）采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法結(jié)合對(duì)艾草生物堿的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化可靠性較高，能夠?yàn)檫M(jìn)一步的試驗(yàn)研究提供依據(jù)。

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