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        4種大孔吸附樹脂對(duì)阿膠低聚肽的脫苦效果研究

        2018-07-04 02:16:54魏芳周祥山田守生劉海峰張建嶺郭曉飛郭興峰
        食品研究與開發(fā) 2018年13期
        關(guān)鍵詞:阿膠苦味大孔

        魏芳,周祥山,田守生,劉海峰,張建嶺,郭曉飛,郭興峰,,*

        (1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山東聊城252000;2.東阿阿膠股份有限公司,山東聊城252201)

        阿膠(Colla corii asini)為馬科動(dòng)物驢(Equus asinus L.)的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠,屬我國(guó)傳統(tǒng)名貴滋補(bǔ)類中藥,也是衛(wèi)生部規(guī)定的藥食兩用資源[1]。阿膠可追溯到2500多年以前,在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《傷寒雜病論》、《本草經(jīng)集》、《名醫(yī)別錄》《齊民要術(shù)》、《本草綱目》等眾多中醫(yī)著作中均有記載,具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、滋陰潤(rùn)燥等功效,被譽(yù)為補(bǔ)血圣藥,與人參、鹿茸一起稱為“中藥三寶”[2-3]?,F(xiàn)代研究表明:阿膠含有膠原蛋白、肽和多種微量元素,對(duì)人體的血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均具有重要作用[4-6]。傳統(tǒng)阿膠塊炮制服用方法繁瑣且不易吸收,對(duì)于脾胃虛弱,消化能力低下的血虛、貧血病人,阿膠藥效得不到充分發(fā)揮,因此,阿膠素有“滋膩礙胃”之說(shuō)[7]。

        通過(guò)現(xiàn)代酶解技術(shù)將阿膠中的膠原蛋白水解為阿膠低聚肽是解決阿膠食用繁瑣、攜帶不便、吸收率低等問(wèn)題的有效途徑,也是傳統(tǒng)中藥現(xiàn)代化的有效途徑[7]。阿膠低聚肽與眾多其他來(lái)源多肽相似,均具有較重的苦味[8-11]。如何降低苦味就成為多肽風(fēng)味改善的重點(diǎn)和難點(diǎn)[8,10,12-13]。目前,多肽的苦味脫除方法大體有:選擇分離法、掩蓋法、酶法、微生物法等[14]。選擇分離法是一種采用吸附、萃取、沉淀、色譜分離等方法將蛋白酶解液中具有苦味的多肽予以除去的方法。其中,樹脂分離法因具有吸附性能好、比表面積大等優(yōu)點(diǎn),目前已廣泛應(yīng)用于生物制藥及天然植物活性成分的提取分離中[15-17]。

        以阿膠低聚肽為原料,通過(guò)靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn),考察了AB-8、DA201-C、DA-201C和D101等4種不同規(guī)格的大孔吸附樹脂對(duì)阿膠低聚肽的吸附、解吸和脫苦效果,并確定了最佳的脫苦工藝,應(yīng)用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)和高效凝膠滲透色譜(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)研究了分離前后樣品氨基酸組成和分子量分布的差別,旨在為阿膠低聚肽的脫苦提供理論依據(jù),同時(shí)為低苦味阿膠低聚肽產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        阿膠低聚肽原粉:東阿阿膠股份有限公司;DA-201C、AB-8、D-101型大孔吸附樹脂(孔徑8 nm~10 nm):天津浩聚樹脂科技有限公司;DA201-C型大孔吸附樹脂(孔徑10 nm):鄭州華溢科技新材料股份有限公司;95%乙醇:萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠;鹽酸:煙臺(tái)市雙雙有限公司;無(wú)水醋酸鈉(分析純):吳江市華順精細(xì)化工有限公司;冰醋酸(分析純):湖北興銀河精細(xì)化工有限公司;乙腈(色譜純):山東豐倉(cāng)化工有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵:鄭州博科儀器設(shè)備有限公司;大孔吸附樹脂用層析柱;OSB-2100式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海愛郎儀器有限公司;FD-1C-50式真空冷凍干燥機(jī):北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司;ME204/02式電子分析天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;LC-100高效液相色譜儀:合肥捷島科學(xué)儀器有限公司;Vensil-AA氨基酸分析方法包(Vensil-AA氨基酸分析專用柱、異硫氰酸苯酯、三乙胺、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、正亮氨酸):天津博納艾杰爾科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樹脂的預(yù)處理

        將不同型號(hào)的大孔吸附樹脂先用一定量的無(wú)水乙醇浸泡24 h,使其充分溶脹,然后將樹脂裝柱,用4~5倍床層體積的無(wú)水乙醇以2 BV/h~3 BV/h的流速通過(guò)樹脂,至流出液在220 nm處無(wú)吸收峰,再用去離子水以3 BV/h~4 BV/h的流速?zèng)_洗至無(wú)乙醇味備用[18]。

        1.3.2 靜態(tài)吸附及解吸試驗(yàn)

        1.3.2.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

        于250 mL具塞錐形瓶中分別加入50 g預(yù)先處理過(guò)的樹脂,再加入100 mL濃度為0.2 g/mL的阿膠低聚肽溶液。用塞子封好后放入20℃的恒溫?fù)u床中振蕩3 h(140次/min),從搖床上取出靜置 3 h[19]。每隔半小時(shí)攪拌一次,使吸附完全。將每個(gè)錐形瓶中的溶劑分別進(jìn)行抽濾并用50 mL去離子水洗滌,把抽濾得到的濾液進(jìn)行濃縮、冷凍干燥、稱重,并按下式計(jì)算吸附當(dāng)量。抽濾剩下的干燥固體樹脂收集備用。

        吸附當(dāng)量/(mg/g)=吸附量/干樹脂質(zhì)量

        1.3.2.2 靜態(tài)解吸試驗(yàn)

        將經(jīng)靜態(tài)吸附后得到的干燥固體樹脂分別置于500 mL具塞錐形瓶中,各加入200 mL無(wú)水乙醇。用塞子封好后放入20℃的恒溫?fù)u床上振蕩3 h(140次/min)。從搖床上取出,將錐形瓶中的溶劑進(jìn)行抽濾。得到的溶液進(jìn)行濃縮,冷凍干燥。將得到的干燥粉末進(jìn)行稱重,按下式計(jì)算解吸率。

        解吸率/%=解吸量/吸附量×100

        1.3.3 動(dòng)態(tài)吸附及解吸試驗(yàn)

        采用濕法裝柱將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的大孔吸附樹脂裝入層析柱中,距柱口約3cm~4cm[20]。分別根據(jù)靜態(tài)吸附及解吸試驗(yàn)結(jié)果,確定的每種樹脂最佳上樣量稱取阿膠低聚肽粉末,按阿膠低聚肽粉末∶去離子水=1 g∶5 mL的比例加入去離子水。用磁力攪拌器攪拌20 min,超聲波超聲30 min。待阿膠低聚肽完全溶解后,將其緩慢加入到裝好的柱子中。分別用25%乙醇和95%乙醇以1 BV/h~2 BV/h的速度洗脫4種大孔吸附樹脂,得到的流出液分別按瓶進(jìn)行收集、濃縮、冷凍干燥。并將得到的干燥固體粉末進(jìn)行稱重,按下式計(jì)算每種大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附及解吸后的回收率。

        回收率/%=總回收量/上樣量×100

        1.3.4 苦味評(píng)價(jià)

        目前,常用的口嘗苦味評(píng)價(jià)方法有排序法、評(píng)分法、排序加評(píng)分法[21]。本文采用排序法和評(píng)分法對(duì)阿膠低聚肽溶液的苦味進(jìn)行評(píng)價(jià),苦味評(píng)價(jià)方法均參照文獻(xiàn)[21]。

        1.3.4.1 排序法

        將25%乙醇分別洗脫4種大孔吸附樹脂得到的干燥固體粉末配制成濃度為2%的樣品溶液,95%乙醇洗脫樹脂得到的干燥固體粉末配制成濃度為1%的樣品溶液。

        以6個(gè)感官評(píng)價(jià)員為一組,每名感官評(píng)價(jià)員需分別評(píng)定兩組共8個(gè)樣品。每組樣品評(píng)定的時(shí)間間隔40 min,每個(gè)樣品間隔時(shí)間為2 min~3 min。評(píng)價(jià)員在感官評(píng)定前2小時(shí)禁食,感官評(píng)價(jià)前用水漱口,取少量溶液放入口中,使樣品充分與味蕾接觸,15 s后吐出漱口,并按照品嘗到的苦味大小按從大到小的順序排列。

        1.3.4.2 評(píng)分法

        以鹽酸奎寧為參比,將配制好的樣品溶液分別與濃度為 1.0×10-4、9.0×10-5、8.0×10-5、7.0×10-5、6.0×10-5、5.0×10-5、4.0×10-5、3.0×10-5、2.0×10-5、1.0×10-5g/mL 的鹽酸奎寧做對(duì)比,其苦味值分別定為10~1。每位感官評(píng)價(jià)員按品嘗到的苦味強(qiáng)度進(jìn)行打分并取平均值[22]。

        1.3.5 阿膠低聚肽分子量分布的測(cè)定

        阿膠低聚肽分子量分布的測(cè)定參考GB/T 22492-2008《大豆肽粉》中大豆肽粉的分子量分布的測(cè)定方法應(yīng)用HPGPC進(jìn)行測(cè)定。色譜條件:色譜柱TSK gel 2000 swxl 300 mm×7.8 mm,流動(dòng)相:乙腈-水-三氟乙酸=45∶55∶0.1(體積比),檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm,流速:0.5 mL/min,柱溫:30 ℃,進(jìn)樣量:10 μL。樣品制備:以流動(dòng)相為溶劑配制濃度為2 mg/mL的樣品溶液并用0.45 μm微孔膜過(guò)濾后進(jìn)樣。標(biāo)準(zhǔn)樣品:將乙胺酸-乙胺酸-乙胺酸(Mw=189)、乙胺酸-乙胺酸-酪氨酸-精氨酸(Mw=451)、桿菌酶(Mw=1450)、抑肽酶(Mw=6500)、細(xì)胞色素C(Mw=12500)配成混標(biāo),每種物質(zhì)含量均為2 mg/mL。將5種標(biāo)準(zhǔn)樣品按2 mg/mL配制,按照上述色譜條件測(cè)定并以lgMw為縱坐標(biāo),以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見圖1。

        圖1 5種標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPGPC圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 HPGPC profiles of five standard samples

        從圖1中可以看到洗脫峰出現(xiàn)時(shí)所對(duì)應(yīng)的洗脫時(shí)間分別為 12.749、14.041、16.871、19.104、20.767 min,以分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值與洗脫時(shí)間作圖,求出直線的回歸方程為:y=-0.227x+6.991(式中:x為洗脫時(shí)間,y為分子質(zhì)量對(duì)數(shù)),其回歸系數(shù)R2=0.963。

        1.3.6 阿膠低聚肽中氨基酸分析

        阿膠低聚肽中氨基酸種類和含量測(cè)定使用Venusil AA氨基酸分析方法包進(jìn)行測(cè)定[23],分別精確稱取80 mg~90 mg阿膠低聚肽及經(jīng)DA201-C大孔吸附樹脂分離后的樣品于安瓿瓶中,加入6 mol/L鹽酸,混勻,封口,110℃烘箱中水解24 h。取水解液濃縮至干燥,加入稀鹽酸溶解后,用0.45 μm濾膜過(guò)濾,取過(guò)濾液貯于0~4℃冰箱中,供衍生使用。準(zhǔn)確量取上述配制好的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液200 μL置于1.5 mL離心管中,依次加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液、三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯溶液,混勻,室溫放置1 h,然后加入正己烷,振搖后放置10 min,取下層溶液用0.45 μm的針式過(guò)濾器過(guò)濾。取部分濾液用水稀釋,搖勻,進(jìn)樣。色譜條件:Venusil AA氨基酸分析柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:10 μL,柱溫:40 ℃,流動(dòng)相,A:稱取15.2 g無(wú)水醋酸鈉,加水1850 mL,溶解后用冰醋酸調(diào)pH值至6.5,然后加乙腈140 mL,混勻,用0.45 μm濾膜過(guò)濾。流動(dòng)相B:80%(體積比)乙腈溶液,流速:1.0 mL/min,梯度洗脫,對(duì)經(jīng)阿膠低聚肽分離前后的氨基酸進(jìn)行分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 4種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)

        不同型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)阿膠低聚肽的吸附與解吸性能見表1。

        表1 不同型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)阿膠低聚肽的吸附與解吸性能Table 1 Adsorption and desorption capabilities of Colla corii asini oligopeptides with different kinds of macroporous adsorptive resins

        從表1可以看出,大孔吸附樹脂AB-8的吸附當(dāng)量最大,依次是D-101、DA201-C,最后是DA-201C。另外比較解吸率可知,DA-201C的解吸率均高于另外3種樹脂。由于,AB-8、D-101和DA-201C3種樹脂的解吸量和吸附量差別較大,不適用于阿膠低聚肽的分離。因此,結(jié)合吸附量和吸附當(dāng)量的結(jié)果可知,大孔吸附樹脂DA201-C對(duì)阿膠低聚肽的分離效果最好。

        2.2 4種大孔吸附樹脂的動(dòng)態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)

        不同型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)阿膠低聚肽的動(dòng)態(tài)吸附性能結(jié)果見表2。

        表2 不同型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)阿膠低聚肽的動(dòng)態(tài)解吸性能Table 2 Dynamic desorption capabilities of Colla corii asini oligopeptides with different kinds of macroporous adsorptive resins

        由表2可以看出,4種大孔吸附樹脂的洗脫率都達(dá)到了90%以上。而其中用25%乙醇洗脫所得組分占了上樣量的大部分比例,用95%乙醇得到的洗脫量較小,可能是因?yàn)橄鄬?duì)分子量較大的組分在95%乙醇中溶解度降低所致[24],同時(shí)說(shuō)明通過(guò)大孔吸附樹脂分離不會(huì)對(duì)樣品造成較大的損失。

        2.3 苦味的評(píng)價(jià)

        2.3.1 排序法結(jié)果與分析

        不同型號(hào)大孔吸附樹脂分離阿膠低聚肽后各組分的苦味排序見表3。

        由表3可知,大孔吸附樹脂DA-201C用25%乙醇洗脫時(shí)得到的洗脫液苦味最重,D-101和AB-8次之,DA201-C的苦味最輕;而用95%乙醇洗脫組分中DA-201C苦味最輕,AB-8和D-101次之,DA201-C苦味最重。趙謀明等[25]認(rèn)為,蛋白水解物苦味的產(chǎn)生,是由于蛋白質(zhì)在水解過(guò)程中疏水性氨基酸殘基暴露在多肽末端引起。因此,大孔吸附樹脂DA201-C和AB-8能夠較好的脫除阿膠低聚肽的苦味,是因?yàn)樵谝欢ū壤掖枷疵摃r(shí)可以有的吸附一定量的疏水性氨基酸。

        表3 經(jīng)不同型號(hào)大孔吸附樹脂分離阿膠低聚肽組分的苦味排序Table 3 The bitter sequence of fractions of Colla corii asini oligopeptides separated by different kinds of macroporous adsorptive resins

        2.3.2 評(píng)分法結(jié)果與分析

        不同型號(hào)大孔吸附樹脂的評(píng)分結(jié)果見表4。

        表4 不同型號(hào)大孔吸附樹脂的評(píng)分結(jié)果Table 4 Results of different macroporous adsorptive resins

        結(jié)合表3和表4可知,排序法與評(píng)分法的結(jié)果一致。從表4可以看出,當(dāng)用25%乙醇洗脫DA201-C大孔吸附樹脂時(shí),得到的阿膠低聚肽組分苦味值最小,為1.3;DA-201C用95%乙醇洗脫時(shí),苦味值為6.3。結(jié)合動(dòng)態(tài)吸附與解吸的試驗(yàn)結(jié)果可知,DA201-C大孔吸附樹脂具有最佳的脫苦效果。

        2.4 分離前后阿膠低聚肽的分子量分布

        通過(guò)前期分離和感官評(píng)價(jià)后發(fā)現(xiàn)DA201-C對(duì)阿膠低聚肽具有較好的脫苦效果,隨后對(duì)分離前后的阿膠低聚肽分子量分布情況進(jìn)行了分析。分析結(jié)果見圖2和圖3。

        圖2 原阿膠低聚肽的分子質(zhì)量分布Fig.2 MolecularweightdistributionofCollacoriiasinioligopeptides

        圖3 乙醇洗脫后阿膠低聚肽的分子質(zhì)量分布Fig.3 Molecular weight distribution of Colla corii asini oligopeptides ethanol elution

        如圖2所示,原阿膠低聚肽溶液中包含3個(gè)組分峰,洗脫時(shí)間分別出現(xiàn)在20.086、21.207、23.276 min,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各峰的對(duì)應(yīng)分子質(zhì)量為270.07、150.32、50.97 Da??梢?,原阿膠低聚肽的分子量分布在50.97 Da~270.07 Da之間。從圖3中可以看出,經(jīng)25%乙醇分離后的阿膠低聚肽溶液中包含4個(gè)組分峰,洗脫時(shí)間分別出現(xiàn)在 16.379、18.276、19.397、22.241 min,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各峰的對(duì)應(yīng)分子質(zhì)量為1874.85、695.58、387.15、87.56 Da。經(jīng)95%乙醇洗脫后的阿膠低聚肽樣品溶液中主要包括3個(gè)組分峰,洗脫時(shí)間分別出現(xiàn)在 18.966、20.172、21.379 min,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各峰的對(duì)應(yīng)分子質(zhì)量為484.97、258.20、137.39 Da。結(jié)合原阿膠低聚肽的分子量可知,25%乙醇和95%乙醇洗脫后得到的分子量有所增加,脫除了阿膠低聚肽中氨基酸類成分,提高了阿膠低聚肽純度。

        2.5 分離前后阿膠低聚肽氨基酸的成分變化

        將經(jīng)DA201-C大孔吸附樹脂分離前后的阿膠低聚肽干粉進(jìn)行氨基酸成分分析,比較分離前后各種氨基酸的含量變化,進(jìn)一步驗(yàn)證其脫苦效果,結(jié)果見表5。

        表5 不同洗脫組分的氨基酸組成Table 5 Total amino acid composition of desorbed fractions

        續(xù)表5 不同洗脫組分的氨基酸組成Continue table 5 Total amino acid composition of desorbed fractions

        不同組分親水性氨基酸和疏水性氨基酸的含量見圖4。

        圖4 不同組分親水性氨基酸和疏水性氨基酸的含量Fig.4 Percentage of hydrophilic amino acids and hydrophobic amino acids in different fraction

        從圖4可以看出,用95%乙醇洗脫DA201-C大孔吸附樹脂時(shí),得到的疏水性氨基酸含量與原樣相比最高,25%乙醇次之,水相最低。馬鐵錚等[14]認(rèn)為疏水性氨基酸的含量與苦味值成正比,疏水性氨基酸的含量越高,苦味值越大。因此,95%乙醇洗脫得到的洗脫液苦味值最大,25%乙醇次之,水相最低。用水相和95%乙醇洗脫DA201-C大孔吸附樹脂時(shí),多數(shù)氨基酸的含量與原樣相比均有明顯變化;25%乙醇洗脫時(shí),除蘇氨酸的含量與原樣相比大幅減少外,其余氨基酸的含量變化均不明顯。因此,用25%乙醇洗脫DA201-C大孔吸附樹脂,能較好的脫除阿膠低聚肽的苦味。

        3 結(jié)論

        本研究應(yīng)用4種大孔吸附樹脂對(duì)阿膠低聚肽進(jìn)行脫苦研究,并對(duì)分離前后的分子量分布和氨基酸組成進(jìn)行分析。結(jié)果表明:大孔吸附樹脂DA201-C對(duì)阿膠低聚肽的脫苦效果優(yōu)于其他3種樹脂,且用體積分?jǐn)?shù)為25%的乙醇作為流動(dòng)相洗脫時(shí),得到的洗脫液苦味較輕,洗脫率達(dá)到了91.07%。利用HPLC測(cè)得分離后阿膠低聚肽中的疏水性氨基酸含量比分離前低,分子量分布在87.56 Da~1874.85 Da之間。該研究為阿膠低聚肽脫苦提供了理論依據(jù),也為阿膠低聚肽的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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