王鵬，郭狄，陳利華，章禮煒，陳海嘯

破骨細(xì)胞的骨吸收和成骨細(xì)胞的骨形成之間的平衡是維持骨骼穩(wěn)定的必要條件［1］。長(zhǎng)期過量的骨吸收破壞了這種平衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［2］、人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)、轉(zhuǎn)移性骨腫瘤等病理性骨損失［2］。由于破骨細(xì)胞的形成和功能增強(qiáng)引起過度骨吸收是產(chǎn)生這些溶骨性病變的主要原因之一，因此通過抑制破骨細(xì)胞的形成可有效防治這些溶骨性疾病。雙膦酸鹽可有效抑制破骨細(xì)胞活性［3］，但其使用會(huì)產(chǎn)生發(fā)熱、骨痛、頜骨壞死［4］、不典型骨折［5］等不良反應(yīng)，因此尋找新的具有抗骨丟失作用的替代藥物仍然具有很大的價(jià)值?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過研究燈心草對(duì)核因子（NF）-κB受體活化因子配體（RANKL）誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的抑制作用，為尋找新型抗溶骨性疾病的藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡清潔級(jí)雄性C57/BL6小鼠購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2013-0016］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 燈心草（提取物，粉劑）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；RANKL和可溶性小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）購自R&D公司；青鏈霉素、胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基均購自Hyclone公司；TRAP染色試劑盒購自Sigma公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。RT-PCR所需的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher公司。Mulitiskan FC型酶標(biāo)儀、倒置熒光顯微鏡（Leica DMIL LED），7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI StepOne plus），高速低溫離心機(jī)（Thermo Fisher）。

1.3 骨髓巨噬細(xì)胞（BMMs）的獲取 取8周齡雄性C57/BL6小鼠，3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉、75%乙醇浸泡消毒，在超凈臺(tái)中分離取出小鼠的股骨和脛骨，PBS沖洗后更換器械，用血管鉗夾住股骨和脛骨，然后用1 mL注射器在股骨脛骨兩端各戳一個(gè)洞，用1 mL注射器吸取α-MEM沖洗出股骨和脛骨中的骨髓。加入含30 μg/L的M-CSF的完全培養(yǎng)基，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，去上清液更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)BMMs至細(xì)胞密度達(dá)到90%。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 消化1.3中的BMMs，按照8×103個(gè)/孔接種在2塊96孔板中，每板接種30個(gè)孔。培養(yǎng)24 h，待BMMs細(xì)胞完全貼壁后，加入含不同濃度（0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L）燈心草的完全培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，隔天換液1次，分別培養(yǎng)48 h、96 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，混勻后在37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)得光密度（OD）值，并計(jì)算BMMs 48 h、96 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.5 BMMs培養(yǎng)及破骨細(xì)胞分化 取8周齡雄性C57BL6小鼠，重新獲取BMMs（如前所述）。消化分離后接種于96孔板中。設(shè)不同濃度（0、6.25、12.5、25 μmol/L）燈心草組，每組3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞密度為8×103個(gè)/孔。在30 μg/L M-CSF配成的完全培養(yǎng)基中培育24 h，待細(xì)胞完全貼壁后加入30 μg/L MCSF、50 μg/L RANKL和（0、6.25、12.5、25 μmol/L）燈心草配成的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d，隔天換液1次，直到觀察到成熟的破骨細(xì)胞形成。棄培養(yǎng)基，PBS清洗3次后，加入4%多聚甲醛固定20 min。加入TRAP染色試劑，37℃培養(yǎng)箱中孵育染色，直至觀察到0 μmol/L燈心草組明顯著色。將TRAP染色陽性且細(xì)胞核超過3個(gè)的細(xì)胞定義為破骨細(xì)胞，在40倍顯微鏡下觀察，并記錄96孔板中每孔的破骨細(xì)胞數(shù)目。

1.6 RT-PCR檢測(cè)破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá) 消化分離1.3中的BMMs細(xì)胞，接種于6孔板中，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，細(xì)胞分組同1.5。48 h換液1次，培養(yǎng)4～5 d，當(dāng)?shù)怪蔑@微鏡中觀察到0 μmol/L燈心草組中出現(xiàn)多核巨細(xì)胞時(shí)終止培養(yǎng)。加入1 mL TRIzol提取總RNA，測(cè)定OD260/280。取1 μg RNA 樣本，1 μL Oligo（dT）18primer ，加入 ddH2O 至 12 μL，65 ℃ 反應(yīng) 5 min；再 加入 4 μL 5× Reaction Buffer、1 μL RiboLock RNase Inhibitor（20 U/μL）、2 μL 10 mmol/L dNTP Mix、1 μL RevertAid M-MulV RT（200 U/μL）；反應(yīng)條件為42℃ 60 min，70℃ 5 min，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-70℃的超低溫冰箱中。取1 μL cDNA模板，8.5 μL ddH2O，分別為0.5 μL的上、下游引物，10 μL SYBR Green；反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。并采用2-ΔΔCt法分析降鈣素受體（CTR）、活化 T 細(xì)胞核因子 1（NFATC1）、空泡型H+三磷酸腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)酶-d2（V-ATPased2）、空泡型H+三磷酸腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)酶-a3（V-ATPase-a3）、CFOS等基因的mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參基因，重復(fù)3次。基因引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度燈心草對(duì)BMMs增殖的影響 CCK-8結(jié)果顯示，藥物濃度低于12.5 μmol/L時(shí)，燈心草對(duì)BMMs增殖無明顯抑制作用，當(dāng)燈心草濃度≥25 μmol/L時(shí)，其對(duì)BMMs開始有毒性作用，且隨著濃度的升高，毒性作用逐漸增強(qiáng)，見圖1。48 h和96 h時(shí)燈心草藥物作用于BMMs的IC50分別為69.51 μmol/L和55.68 μmol/L。

Tab.1 Primers for RT-PCR表1RT-PCR引物序列表

Fig.1 The effects of 0-200 μmol/L of Juncus effuses on proliferation of BMMs cells圖1 不同濃度燈心草對(duì)BMMs細(xì)胞增殖的影響

2.2 不同濃度燈心草對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成的影響 在RANKL的刺激下，0 μmol/L燈心草組中可見BMMs形成大量的TRAP染色陽性的多核巨細(xì)胞，即成熟的破骨細(xì)胞；在不同濃度的燈心草作用下，TRAP染色陽性的多核巨細(xì)胞明顯減少，并且隨著藥物濃度的升高，破骨細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，見圖2。

Fig.2 The effects of different concentrations of Juncus on RANKL-induced osteoclastogenesis圖2 不同濃度燈心草對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成的影響

2.3 不同濃度燈心草對(duì)破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，與0 μmol/L燈心草組相比，6.25、12.5、25 μmol/L燈心草可顯著抑制破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。見圖3。

3 討論

3.1 破骨細(xì)胞增多是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的主要原因之一 骨質(zhì)疏松癥是一種無聲的疾病，很多人直到發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折時(shí)才發(fā)現(xiàn)［6］。骨質(zhì)疏松性骨折嚴(yán)重影響患者健康，給社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。破骨細(xì)胞數(shù)目增加和骨吸收活性增強(qiáng)是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥等疾病發(fā)生的主要原因［7］。研究表明，RANKL和破骨細(xì)胞表面的受體RANK結(jié)合是破骨細(xì)胞形成的重要因素［8］，其相互結(jié)合后迅速激活多個(gè)不同的信號(hào)通路介導(dǎo)的蛋白激酶，參與破骨細(xì)胞的形成。如MAPK信號(hào)通路的活化可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生NFATC1等轉(zhuǎn)錄因子［9］，進(jìn)而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成［10-11］。另外，P38信號(hào)通路蛋白的磷酸化也可促進(jìn)NFATC1蛋白的產(chǎn)生［12］。RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過程中會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NFATC1的過表達(dá)，然而即使沒有RANKL的刺激，NFATC1轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)也能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成［7］。因此，RANKL激活NFATC1基因的過表達(dá)是促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、增強(qiáng)其骨吸收活性的關(guān)鍵因素之一［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，CTR是破骨細(xì)胞上最早發(fā)現(xiàn)的一種受體，為破骨細(xì)胞的特征性標(biāo)志之一［14］。另有研究表明，V-ATPase位于骨和破骨細(xì)胞的質(zhì)膜，其作用是促進(jìn)氫離子的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)破骨細(xì)胞的骨吸收能力［15］。因此，研究藥物抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成、骨吸收功能及其機(jī)制，可以為治療骨質(zhì)疏松癥等溶骨性疾病提供可靠的依據(jù)。

Fig.3 The effects of different concentrations of Juncus on expression levels of CTR,NFATC1,V-ATPase-a3,V-ATPase-d2 and C-FOS mRNA圖3 不同濃度燈心草對(duì)破骨細(xì)胞分化過程中CTR、NFATC1、V-ATPase-a3、V-ATPase-d2及C-FOS mRNA表達(dá)的影響

3.2 燈心草對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制作用 我國醫(yī)學(xué)發(fā)展的研究表明，中草藥可以有效治療多種慢性疾病［16］。有研究發(fā)現(xiàn)，燈心草提取物可以有效抑制脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，具有良好的抗炎效果［17］。本研究通過CCK-8實(shí)驗(yàn)篩選出燈心草對(duì)BMMs無明顯毒性的濃度，用于探索其對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響。通過記錄TRAP染色陽性的多核巨細(xì)胞的數(shù)目來評(píng)價(jià)燈心草對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響，結(jié)果顯示燈心草可顯著抑制破骨細(xì)胞的形成，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。此外，研究發(fā)現(xiàn)燈心草可顯著抑制破骨細(xì)胞特異性基因CTR、NFATC1、V-ATPase-d2、V-ATPase-a3、C-FOS 等mRNA的表達(dá)，并且呈現(xiàn)了一定的濃度依賴性。由此進(jìn)一步證明燈心草對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制作用，其機(jī)制可能是通過抑制破骨細(xì)胞形成中特異性基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，燈心草可顯著抑制破骨細(xì)胞的形成及其特異性基因的表達(dá)。本研究結(jié)果可能預(yù)示了燈心草在預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)等溶骨性疾病具有潛在的價(jià)值，但其作用于破骨細(xì)胞的明確靶點(diǎn)和臨床應(yīng)用方式仍然需要進(jìn)一步研究。

［1］Liu Q，Wang T，Zhou L，et al.Nitidine chloride prevents OVX-induced bone loss via suppressing NFATc1-mediated osteoclast differentiation［J］.Sci Rep，2016，6：36662.doi：10.1038/srep36662.

［2］Ma J，Ma Y，Liu X，et al.Gambogic acid inhibits osteoclast formation and ovariectomy-induced osteoporosis by suppressing the JNK，p38 and Akt signalling pathways［J］.Biochem J，2015，469（3）：399-408.doi：10.1042/BJ20150151.

［3］Qaseem A，Snow V，Shekelle P，et al.Pharmacologic treatment of low bone density or osteoporosis to prevent fractures：a clinical practice guideline from the American College of Physicians［J］.Ann Intern Med，2008，149（6）：404-415.

［4］Salesi N，Pistilli R，Marcelli V，et al.Bisphosphonates and oral cavity avascular bone necrosis：a review of twelve cases［J］.Anticancer Res，2006，26（4B）：3111-3115.

［5］ Suresh E，Pazianas M，Abrahamsen B. Safety issues with bisphosphonate therapy for osteoporosis ［J］. Rheumatology（Oxford），2014，53（1）：19-31. doi：10.1093/rheumatology/ket236.

［6］ Pinkerton JV，Thomas S，Dalkin AC. Osteoporosis treatment and prevention for postmenopausal women： current and future therapeutic options［J］. Clin Obstet Gynecol，2013，56（4）：711-721. doi：10.1097/GRF.0b013e3182a9fb02.

［7］ Wang W，Wu C，Tian B，et al. The inhibition of RANKL-induced osteoclastogenesis through the suppression of p38 signaling pathwayby naringenin and attenuation of titanium-particle-induced osteolysis［J］. Int J Mol Sci，2014，15（12）：21913-21934. doi：10.3390/ijms151221913.

［8］Lacey DL，Boyle WJ，Simonet WS，et al.Bench to bedside：elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab［J］.Nat Rev Drug Discov，2012，11（5）：401-419.doi：10.1038/nrd3705.

［9］Zwerina J，Hayer S，Redlich K，et al.Activation of p38 MAPK is a key step in tumor necrosis factor-mediated inflammatory bone destruction［J］.Arthritis Rheum，2006，54（2）：463-472.doi：10.1002/art.21626.

［10］Strait K，Li Y，Dillehay DL，et al.Suppression of NF-kappaB activation blocks osteoclastic bone resorption during estrogen deficiency［J］.Int J Mol Med，2008，21（4）：521-525.doi：10.3892/ijmm.21.4.521.

［11］Meissner JD，F(xiàn)reund R，Krone D，et al.Extracellular signalregulated kinase 1/2-mediated phosphorylation of p300 enhances myosin heavy chain I/beta gene expression via acetylation of nuclear factor of activated T cells c1［J］.Nucleic Acids Res，2011，39（14）：5907-5925.doi：10.1093/nar/gkr162.

［12］Choi J，Choi SY，Lee SY，et al.Caffeine enhances osteoclast differentiation and maturation through p38 MAP kinase/Mitf and DC-STAMP/CtsK and TRAP pathway［J］.Cell Signal，2013，25（5）：1222-1227.doi：10.1016/j.cellsig.2013.02.015.

［13］Ikeda F，Nishimura R，Matsubara T，et al.Critical roles of c-Jun signaling in regulation of NFAT family and RANKL-regulated osteoclast differentiation［J］.J Clin Invest，2004，114（4）：475-484.doi：10.1172/JCI19657.

［14］Jiao Z，Xu W，Zheng J，et al.Kaempferide prevents titanium particle induced osteolysis by suppressing JNK activation during osteoclast formation［J］.Sci Rep，2017，7（1）：16665.doi：10.1038/s41598-017-16853-w.

［15］Costa-Rodrigues J，Reis S，Teixeira S，et al.Dose-dependent inhibitory effects of proton pump inhibitors on human osteoclastic and osteoblastic cell activity［J］.FEBS J，2013，280（20）：5052-5064.doi：10.1111/febs.12478.

［16］Jiang M，Zhang C，Cao H，et al.The role of Chinese medicine in the treatment of chronic diseases in China［J］.Planta Med，2011，77（9）：873-881.doi：10.1055/s-0030-1270983.

［17］Park NY，Kim SG，Park HH，et al.Anti-inflammatory effects of Juncus effusus extract（JEE）on LPS-stimulated RAW 264.7 cells and edema models［J］.Pharm Biol，2016，54（2）：243-250.doi：10.3109/13880209.2015.1029053.