羅寶昌 張敬

腦卒中是指由于腦循環(huán)障礙所致的局部或全面性腦功能缺損綜合征，現(xiàn)已成為全球致死率及致殘率較高的神經系統(tǒng)疾病[1]。腦卒中主要分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類，其中缺血性腦卒中患者占66.7%左右[2]。缺血性腦卒中的發(fā)病機制復雜，不僅與大量的傳統(tǒng)危險因素相關，而且基因多態(tài)性也嚴重影響缺血性腦卒中的發(fā)生[3-4]。

APOE基因位于染色體上以三種等位基因ε2、ε3和ε4形式存在，分別編碼三種不同的蛋白亞型E2、E3和E4[5]。三種蛋白亞型僅表現(xiàn)為112位和158位氨基酸的差異，從而導致脂質親和力的差異而可能影響缺血性腦卒中發(fā)生[4]。APOE基因多態(tài)性與腦卒中的相關性目前尚未定論，部分學者認為APOE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中具有相關性[6-7]，而部分學者認為兩者之間無明顯相關性[8-10]。地區(qū)和種族可能是影響結果的一個因素，而漢川市漢族人群APOE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的發(fā)生是否相關，尚未見相關報道。

Slco1B1基因位于染色體上，具有高度遺傳多態(tài)性，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)40個以上的非同義單核苷酸多態(tài)性位點。他汀類藥物如匹伐他汀、新伐他汀、普伐他汀等是治療缺血性腦卒中的常見藥物。研究發(fā)現(xiàn)Slco1B1基因位點rs4149056(521T>C)多態(tài)性影響他汀類藥物的吸收，從而對療效產生影響[11-12]。而Slco1B1基因位點rs4149056多態(tài)性與缺血性腦卒中的發(fā)生是否相關，尚未見相關報道。

本研究通過直接測序法分析缺血性腦卒中患者和健康對照人群ApoE基因型及Slco1B1 rs4149056位點基因型，從而進一步研究ApoE基因和Slco1B1多態(tài)性與漢川市漢族人群缺血性腦卒中的相關性，為揭示缺血性腦卒中發(fā)病機制及缺血性腦卒中的預防及治療提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 一般資料及納入、排除標準

選取2015年6月-2017年6月本院收治450例缺血性腦卒中患者為實驗組，同時選取同期于本院體檢的450例正常人為對照組，研究對象均來自漢川市漢族人群。納入標準：診斷參考全國腦血管病學術會議制定的診斷標準，并經腦CT或MRT檢查證實。排除標準：嚴重感染、肝腎功能異常、惡性腫瘤、甲狀腺和血液系統(tǒng)疾病等患者。

1.2 基因組DNA提取

清晨收集受試者空腹外周靜脈血2 mL，加入抗凝劑后混勻。根據(jù)OMEGA公司試劑盒Blood DNA kit說明書提取基因組DNA后-20 ℃保存。

1.3 克隆及測序

根據(jù)Qiagen公司Hotstar Taq Master Mix試劑盒進行PCR反應(引物序列見表1)。PCR反應體系為總體積25 μL，其中模板6 μL(約100 ng)，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，去離子水4.5 μL。 PCR反應條件為95 ℃預變性5 min， 95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR情況，選擇陽性克隆送至華大基因進行測序，GeneMapper軟件用于基因分型。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 一般資料比較

2組性別、年齡、身高、體重均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 PCR引物列表

表2 一般資料比較

2.2 ApoE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關性

對照組基因型頻率都符合Hardy-weinberg平衡(P=0.982)(表3)?；蛐头治霭l(fā)現(xiàn)2組中均含有ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4和ε4/ε4 6種基因型，2組基因型有顯著性差異(P=0.034)(表4)。與ε3/ε3基因型比較，ε2/ε4、ε3/ε4和ε4/ε4基因型可能更易患缺血性腦卒中，分別為OR=3.219，95%CI=1.156～8.963；OR=1.391，95%CI=0.969～1.998和OR=3.219，95%CI=0.645～16.069。

2.3 Slco1B1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關性

對照組基因型頻率都符合Hardy-weinberg平衡(P=0.469)(表5)。對照組T>C突變頻率為11%，而實驗組突變頻率則達到15.2%，2組基因型有顯著性差異(P=0.031)(表6)。與TT基因型比較，TC和CC基因型可能更易患缺血性腦卒中，分別為OR=1.290，95%CI=0.929～1.790；和OR=2.568，95%CI=1.109～5.945。

表3 對照組ApoE基因型Hardy-weinberg平衡

表4 實驗組和對照組ApoE基因型分布

表5 對照組Slco1B1基因型Hardy-weinberg平衡

表6 實驗組和對照組Slco1B1基因型分布

3 討 論

載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是一種富含精氨酸的堿性蛋白，可通過調節(jié)膽固醇及脂類物質的存儲和再分布影響血漿蛋白代謝，同時參與組織修復、抑制血小板聚集等生理過程，并在神經系統(tǒng)的正常生長過程中及損傷后的修復過程中發(fā)揮作用[13]。截至目前，APOE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關性研究很多，但結論具有一些分歧[6-10]。本研究結果表明，漢川市漢族人群APOE基因多態(tài)性可能與缺血性腦卒中相關，ε2/ε4、ε3/ε4和ε4/ε4基因型可能更易患缺血性腦卒中，這與部分學者研究結果一致[6-7]，但與Gu 等研究結果存在差異[8-10]。出現(xiàn)不同結果的原因可能是由于研究方法及納入群體的差異所致。例如Gu等發(fā)現(xiàn)廣西漢族APOE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中無關，而通過Meta分析又發(fā)現(xiàn)漢族APOE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中有關[8]。

Slco1B1基因編碼蛋白質陰離子轉運多肽(OATP1B1)，陰離子轉運多肽(OATP1B1)是一種特異性表達于肝細胞基底膜上轉運蛋白，介導多種內源性或外源性物質從血液向肝細胞的跨膜轉運[14-15]。SLCO1B1 rs4149056是常見的具有功能意義的SNP位點，其在不同種族人群中的分布存在很大的差異，在高加索人、非洲人和亞洲人中突變概率分別為15%～20%，1%～2%和10%～15%[16-18]。本研究對照組rs4149056突變頻率為11%，而實驗組突變頻率為15.2%，這均與已報到的亞洲人群突變頻率報道接近[18]。本研究發(fā)現(xiàn)Slco1B1基因rs4149056位點多態(tài)性可能與缺血性腦卒中有關，TC和CC基因型可能更易患缺血性腦卒中，等位基因C可能是腦卒中易感基因。

本研究結果顯示，對照組APOE基因型和Slco1B1基因型都符合Hardy -weinberg平衡，這表明抽樣具有代表性，適合于后續(xù)遺傳分析(P=0.982和P=0.469)。通過病例-對照研究發(fā)現(xiàn)，漢川市漢族人群APOE基因多態(tài)性及Slco1B1基因rs4149056位點多態(tài)性可能與缺血性腦卒中有關。

本研究具有一定的局限性。一部分是樣本數(shù)相對較少，可能會對結果產生影響，后期需擴大樣本；另一部分是需多因素考慮，需排除個人生活習慣等造成的影響，后期需多因素綜合分析，從而得出更準確的結論。

綜上所述，漢川市漢族人群APOE基因多態(tài)性及Slco1B1基因rs4149056位點多態(tài)性可能與缺血性腦卒中有關。后期需加大樣本量和多因素綜合分析來進一步探索APOE基因多態(tài)性及Slco1B1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關性。

[1] Go AS,Mozaffarian D,Roger VL,et al.Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association[J].Circulation,2014,129(3):e28-e292.

[2] Wang Y,Cui L,Ji X,et al.The China National stroke registry for patients with acute cerebrovascular events: design, rationale, and baseline patient characteristics[J].Int J Stroke,2011,6(4):355-361.

[3] Schulz UG,Flossmann E,Rothwell PM.Heritability of ischemic stroke in relation to age, vascular risk factors, and subtypes of incident stroke in population-based studies[J].Stroke,2004,35(4):819-824.

[4] Ribalta J VJ,Apolipoprotein RG.Blood lipids and disease[J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2003,6(2):177-187.

[5] Utermann G. Isolation and partial characterization of an arginine-rich apolipoprotein from human plasma very-low-density lipoproteins: apolipoprotein E[J]. Hoppe Seylers Z Physiol Chem, 1975,356(2):1113-1121.

[6] Banerjee I,Gupta V,Ganesh S.Association of gene polymorphism with genetic susceptibility to stroke in Asian populations: a meta-analysis[J].J Hum Genet,2007,52(3):205-219.

[7] Wei LK,Au A,Menon S,et al.Clinical relevance of MTHFR, eNOS, ACE, and ApoE gene polymorphisms and serum vitamin profile among malay patients with ischemic stroke[J].J Stroke Cerebrovasc Dis,2015,24(9):2017-2025.

[8] Gu L,Su L,Chen Q,et al.Association between the apolipoprotein E gene polymorphism and ischemic stroke in Chinese populations: New data and meta-analysis[J].Exp Ther Med,2013,5(3):853-859.

[9] Lai CL,Liu CK,Lin RT,et al.Association of apolipoprotein E polymorphism with ischemic stroke subtypes in Taiwan[J].Kaohsiung J Med Sci,2007,23(10):491-497.

[10] Sturgeon JD,Folsom AR,Bray MS,et al.Apolipoprotein E genotype and incident ischemic stroke: the Atherosclerosis Risk in Communities Study[J].Stroke,2005,36(11):2484-2486.

[11] Takane H. Genetic polymorphisms of SLCO1B1 for drug pharmacokinetics and its clinical implications[J]. Yakugaku Zasshi Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 2011,131(11):1589.

[12] 隋雙明,溫金華,李新華,等.OATP1B1基因位點521T→C的突變對瑞舒伐他汀在中國健康人體內藥代動力學特征的影響[J].藥學學報,2011,46(6):695-700.

[13] Liu CC,Liu CC,Kanekiyo T,et al.Apolipoprotein E and alzheimer disease: risk, mechanisms and therapy[J].Nat Rev Neurol,2013,9(2):106-118.

[14] Abe T,Kakyo M,Tokui T,et al.Identification of a novel gene family encoding human liver-specific organic anion transporter LST-1[J].J Biol Chem,1999,274(24):17159-17163.

[15] K nig J,Cui Y,Nies AT,et al.A novel human organic anion transporting polypeptide localized to the basolateral hepatocyte membrane[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2000,278(1):G156-G164.

[16] Niemi M,Pasanen MK,Neuvonen PJ.Organic anion transporting polypeptide 1B1: a genetically polymorphic transporter of major importance for hepatic drug uptake[J].Pharmacol Rev,2011,63(1):157-181.

[17] Xu LY,He YJ,Zhang W,et al.Organic anion transporting polypeptide-1B1 haplotypes in Chinese patients[J].Acta Pharmacol Sin,2007,28(10):1693-1697.

[18] Pasanen MK,Neuvonen PJ,Niemi M.Global analysis of genetic variation in SLCO1B1[J].Pharmacogenomics,2008,9(1):19-33.