劉歡 何國厚 張兆輝 艾志兵

腦梗死是由于動脈粥樣硬化大動脈疾病、小動脈疾病(腔隙性腦梗死)或心臟栓塞等原因引起血管嚴重狹窄或閉塞，供血區(qū)腦組織發(fā)生缺血性壞死，進而出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損的腦血管疾病。目前腦梗死的治療方法主要是通過藥物及血管內治療使血管再通，盡早恢復缺血半暗帶的血液供應，保護尚未壞死的神經(jīng)元，減輕腦水腫，從而有效降低腦梗死的致殘、致死率。PLGF是一種主要表達于胎盤中的血管生長蛋白，在心肌缺血等病理狀態(tài)下其表達明顯上調，也可通過調節(jié)VEGF的活性間接發(fā)揮腦保護作用，因此也被認為是一種很有潛力的治療缺血性疾病的血管生成因子[1]。目前對PLGF在腦梗死方面的研究十分有限，近年有研究發(fā)現(xiàn)PLGF與腦梗死患者預后有關[2]。但對于腦梗死后各時期及不同梗死面積PLGF水平的變化，國內外未見相關報道。本研究通過測定腦梗死患者血漿PLGF水平，來探討PLGF水平在腦梗死后不同時期和不同梗死面積中的變化及意義，從而為腦梗死診斷、病情嚴重程度及預后評估提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年2月-2017年7月在十堰市太和醫(yī)院神經(jīng)內科住院治療的92例腦梗死患者(腦梗死組)及46例同期住院的非腦血管病患者(對照組)作為研究對象，腦梗死的診斷參照我國第四屆腦血管疾病學術會議修訂的腦梗死診斷標準，并經(jīng)顱腦CT和(或)MRI檢查進一步證實。根據(jù)腦梗死發(fā)病時間長短將腦梗死組分為急性期組和恢復期組，規(guī)定急性期組發(fā)病時間為7 d內，恢復期組為發(fā)病后7～30 d。采用顱腦CT或MRI測定所有腦梗死患者最大梗死直徑，根據(jù)直徑大小將腦梗死患者分為大面積梗死組(≥5 cm)、中面積梗死組(2～5 cm)和小面積梗死組(≤2 cm)。所有納入對象均簽署知情同意書并且需排除以下情況：既往有腦梗死和(或)腦出血病史、近3個月來頭部外傷史、嚴重的肝腎功能異常、血液系統(tǒng)疾病、全身系統(tǒng)感染、腫瘤、自身免疫性疾病、妊娠或哺乳期婦女。

1.2 方法

1.2.1 一般資料記錄 記錄所有研究對象的年齡、性別、吸煙史、高血壓病史、糖尿病史、冠心病史，入院后均行血常規(guī)、肝腎功能、凝血功能、血脂、血糖、HCY、hsCRP及顱腦CT和(或)MRI檢查。

1.2.2 標本采集及PLGF水平測定 所有研究對象均在入院后第2 d清晨空腹抽取靜脈血4 mL，肝素鈉抗凝，并在標本采集后30 min內于4 ℃ 1 000 r/min離心15 min，然后取上清置于EP管內，置于-80℃冰箱內保存，避免反復凍融，待所有標本采集完畢后進行集中檢測。測定前將PLGF-ELISA試劑盒中所有試劑及標本緩慢均衡至室溫(18～25℃)，并在操作前15 min配置好實驗所需要的試劑。實驗方法：加樣(標準品或樣本)100 uL，37 ℃孵育1 h；甩干，加檢測溶液A 100 uL，37 ℃孵育1 h；洗板3次；加檢測溶液B 100 uL，37 ℃孵育30 min；洗板5次；加TMB底物90 uL，37 ℃避光孵育10～20 min；加終止液50 uL，立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔光密度(OD值)，繪制標準曲線，由標準曲線計算出樣品水平。

1.2.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 腦梗死組和對照組一般資料比較

腦梗死組和對照組年齡、性別、吸煙史、高血壓病史、糖尿病史、冠心病病史、HDL及LDL水平比較均無明顯差異(P>0.05)；腦梗死組TC、TG、HCY、hsCRP、PLGF水平高于對照組(P<0.05)(表1)。

表1 腦梗死組和對照組患者一般資料比較

2.2 不同時期腦梗死患者血漿PLGF水平比較

腦梗死急性期組PLGF水平高于恢復期組，但無明顯差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同時期腦梗死患者血漿PLGF水平比較)

2.3 不同梗死面積腦梗死患者血漿PLGF水平比較

小面積梗死組血漿PLGF水平明顯低于中面積及大面積梗死組(P<0.05)；大面積梗死組血漿PLGF水平明顯高于中面積梗死組(P<0.05)(表3)。

3 討 論

VEGF是第1個被用于研究腦梗死的血管生長因子，它不僅可促進缺血腦組織的血管生成，減少梗死體積，還具有促進神經(jīng)組織再生和神經(jīng)保護作用[3-4]。我國學者研究發(fā)現(xiàn)腦梗死組患者發(fā)病后第2、7及14 d血清VEGF水平均明顯高于對照組，說明VEGF可能參與了腦梗死的病理生理過程，且VEGF水平與腦梗死患者的病情輕重及預后密切相關,腦損傷越重、梗死灶體積越大、預后較好,VEGF水平越高[5]。PLGF是由Maglione等人最早在胎盤cDNA庫中分離得到的與VEGF結構高度相似的糖化二聚體蛋白，是CPA內皮細胞的促分裂原[6-7]，能和Flt-1/VEGFR-1、神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1，NRP1)和神經(jīng)纖毛蛋白-2(neuropilin-1，NRP2)受體結合，但不能和Flk-1/VEGFR-2受體結合[7-9]。PLGF作為VEGF家族七大成員之一(還有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F)，對血管生長有著不可忽視的作用，可刺激缺血心肌、肢體的血管發(fā)生和動脈生成，刺激成熟非滲漏血管的形成[10]。有研究發(fā)現(xiàn)PLGF基因敲除小鼠在全身缺氧情況下腦血管生長反應延遲，生成的血管不穩(wěn)定，增加腦通透性[11]。Liu等通過MRI和組織學分析發(fā)現(xiàn)PLGF誘導血管發(fā)生不會引起腦水腫[12]。另外，在受損心肌中也發(fā)現(xiàn)PLGF誘導血管生成可避免VEGF引起的一些副作用，如引起水腫、纖維蛋白原沉積、不穩(wěn)定血管結及腎小球樣小體的生成[13-14]。因此，PLGF比VEGF在治療缺血性疾病方面更具有優(yōu)勢，有望成為治療缺血性疾病的新型藥物。

表3 不同梗死面積腦梗死患者血漿PLGF水平比較)

注：與小面積梗死組比較，*P<0.05;與中面積梗死組比較，#P<0.05

本研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者血漿PLGF水平明顯高于對照組，說明PLGF可能參與了腦梗死的病理生理過程?；A研究發(fā)現(xiàn)，在正常小鼠腦內PLGF mRNA和蛋白質遍及所有神經(jīng)元中，而血管和星形細胞中不能表達PLGF。在腦梗死發(fā)生后PLGF表達首先在缺血的神經(jīng)元中上調，在大腦中動脈閉塞(MCAO)后24 h達峰值，隨后逐漸下降，在MACO 3 d完全缺乏表達；PLGF mRNA和蛋白質的表達在梗死區(qū)及其周圍的血管內(MCAO后3 d達峰值)、梗死區(qū)的巨噬細胞(MCAO后3～7 d)、缺血邊界區(qū)的神經(jīng)元和星形膠質細胞(僅PLGF蛋白)中也發(fā)生上調[15]。PLGF在大鼠CNS中表達，尤其在腦缺血后的腦微血管和間質中，還參與到腦缺血過程中，PLGF釋放對糖氧剝奪受損神經(jīng)元具有神經(jīng)保護作用[16]。Liu等對永久性大腦中動脈閉塞模型大鼠分別靜脈轉染人類骨髓間充質干細胞(hMSCs)和過多分泌PLGF的hMSCs(PLGF-hMSCs)，發(fā)現(xiàn)兩種細胞類型均可誘導缺血腦組織內PLGF水平升高，從而減少缺血腦組織體積，增加血管生成，改善受損的神經(jīng)功能，且PLGF-hMSC發(fā)揮的效應更強，說明PLGF在腦梗死后可促進血管生成、保護受損神經(jīng)細胞[12]。PLGF促進血管生成、營養(yǎng)及保護神經(jīng)細胞的可能機制如下[17-20]：①直接與Flt-1/VEGFR-1受體結合，刺激特異性酪氨酸殘基磷酸化和下游不同靶基因表達，從而促進血管內皮細胞增殖、遷移及分化；②PLGF可以將VEGF從Flt-1/VEGFR-1中分離出來，使VEGF激活Flk/VEGFR-2發(fā)揮作用；③PLGF作為一種刺激劑，可增強VEGF與Flk/VEGFR-2結合后產(chǎn)生的生物學效應；④招募對血管生長至關重要的單核細胞及巨噬細胞；⑤動員骨髓中的造血祖細胞；⑥NRP作為VEGF和PLGF的共同受體，在血管生成及神經(jīng)保護方面也具有重要作用，NRP-1增強了VEGF誘導的內皮細胞趨化性以及VEGF與Flk/VEGFR-2的結合。Carmeliet等發(fā)現(xiàn)體內缺乏PLGF會減少缺血肢體、炎癥及腫瘤等病理狀態(tài)下的血管新生、血管滲透性發(fā)生和側枝形成[21]。Luna也發(fā)現(xiàn)PLGF基因缺陷小鼠側支血管和Wills環(huán)前部血管數(shù)量明顯減少[22]，這提示PlGF還可通過促進側支循環(huán)形成來參與腦梗死的病理生理過程。國內學者研究也發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死患者血漿PIGF水平顯著高于對照組，從臨床角度說明了PlGF與腦梗死可能具有相關性，且PlGF在不同病因腦梗死的發(fā)病機制中權重不同[23]。

本實驗結果還顯示，腦梗死急性期組血漿PLGF水平明顯高于恢復期組，但卻沒有統(tǒng)計學意義，說明腦梗死患者血漿PLGF水平可能與病程無關。另外，因為本實驗規(guī)定急性期時間為發(fā)病7 d內，所以也有可能是因為血漿PLGF水平在這7 d前已達高峰，隨后又逐漸下降，最終保持于和恢復期相當?shù)乃剑斐勺罱K2組PLGF水平無統(tǒng)計學差異。因此，后期我們還需對腦梗死患者PLGF水平進行急性期多時間點的檢測，探討PLGF水平在急性期的動態(tài)變化。本研究還進一步分析了血漿PLGF水平與不同梗死面積的關系，發(fā)現(xiàn)大、小、中梗死面積之間PLGF水平具有顯著差異，且具有統(tǒng)計學意義，提示PLGF可能還與腦梗死病情程度有關，即梗死面積越大，病情越重，PLGF水平越高。但本實驗樣本量仍相對較少，以后還需大量的臨床試驗證實結果的可靠性。

綜上所述，腦梗死患者PLGF水平較非腦血管病患者明顯升高，提示PLGF可能通過促進血管生長、營養(yǎng)保護神經(jīng)、促進側支形成等多種不同機制參與了腦梗死的病理生理過程；另一方面PLGF水平還與腦梗死面積密切相關，在一定程度上可作為判斷腦梗死患者的病情程度的血液學指標。

[1] Iyer S,Acharya KR.Role of placenta growth factor in cardiovascular health[J].Trends Cardiovasc Med,2002,12(3):128-134.

[2] 黃晴,陳德.腦梗死患者急性期外周血胎盤因子水平與預后的相關性研究[J].臨床內科雜志,2012,29(6):392-394.

[3] Wang YQ,Guo X,Qiu MH,et al.VEGF overexpression enhances striatal neurogenesis in brain of adult rat after a transient middle cerebral artery occlusion[J].J Neurosci Res,2007,85(1):73-82.

[4] Sun Y,Jin K,Xie L,et al.VEGF-induced neuroprotection, neurogenesis, and angiogenesis after focal cerebral ischemia[J].J Clin Invest,2003,111(12):1843-1851.

[5] 王翠蘭,石秋艷,孫原,等.急性腦梗死患者血清VEGF與bFGF水平的動態(tài)變化[J].中風與神經(jīng)疾病雜志,2014,31(4):292-294.

[6] Maglione D,Guerriero V,Viglietto G,et al.Isolation of a human placenta cDNA coding for a protein related to the vascular permeability factor[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88(20):9267-9271.

[7] De Falco S.The discovery of placenta growth factor and its biological activity[J].Experimental and Molecular Medicine,2012,44(1):1-9.

[8] Sawano A,TakahashiT,Yamaguchi S,et al.Flt-1 but not KDR/Flk-1 tyrosine kinase is a receptor for placenta growth factor,which is related to vascular endothelial growth factor[J].Cell Growth Differ,1996,7:213-221.

[9] Neufeld G,Kessler O,Herzog Y.The interaction of Neuropilin-1 and Neuropilin-2 with tyrosine-kinase receptors for VEGF[J].Adv Exp Med Biol,2002,515:81-90.

[10] Luttun A,Tjwa M,Moons L,et al.Revascularization of ischemic tissues by PlGF treatment, and inhibition of tumor angiogenesis, arthritis and atherosclerosis by anti-Flt1[J].Nat Med,2002,8(8):831-840.

[11] Freitas-Andrade M,Carmeliet P,Charlebois C,et al.PlGF knockout delays brain vessel growth and maturation upon systemic hypoxic challenge[J].J Cereb Blood Flow Metab,2012,32(4):663-675.

[12] Liu H,Honmou O,Harada K,et al.Neuroprotection by PlGF gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischaemia[J].Brain,2006,129(10):2734-2745.

[13] Luttun A,Tjwa M,Carmeliet P.Placental growth factor (PlGF) and its receptor Flt-1 (VEGFR-1): novel therapeutic targets for angiogenic disorders[J].Ann N Y Acad Sci,2002,979:80-93.

[14] Pettersson A,Nagy JA,Brown LF,et al.Heterogeneity of the angiogenic response induced in different normal adult tissues by vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor[J].Lab Invest,2000,80(1):99-115.

[15] Beck H,Acker T,P schel AW,et al.Cell type-specific expression of neuropilins in an MCA-occlusion model in mice suggests a potential role in post-ischemic brain remodeling[J].J Neuropathol Exp Neurol,2002,61(4):339-350.

[16] Du H,Li P,Pan Y,et al.Vascular endothelial growth factor signaling implicated in neuroprotective effects of placental growth factor in an in vitro ischemic model[J].Brain Res,2010,1357:1-8.

[17] Soker S,Miao HQ,Nomi M,et al.VEGF165 mediates formation of complexes containing VEGFR-2 and neuropilin-1 that enhance VEGF165-receptor binding[J].J Cell Biochem,2002,85(2):357-368.

[18] Ribatti D.The discovery of the placental growth factor and its role in angiogenesis: a historical review[J].Angiogenesis,2008,11(3):215-221.

[19] Zhao B,Cai J,Boulton M.Expression of placenta growth factor is regulated by both VEGF and hyperglycaemia via VEGFR-2[J].Microvasc Res,2004,68(3):239-246.

[20] Dewerchin M,Carmeliet P.PlGF: A multitasking cytokine with Disease-Restricted activity[J].Cold Spring Harb Perspect Med,2012,2(8):1-24.

[21] Carmeliet P,Moons L,Luttun A,et al.Synergism between vascular endothelial growth factor and placental growth factor contributes to angiogenesis and plasma extravasation in pathological conditions[J].Nat Med,2001,7(5):575-583.

[22] Luna RL,Kay VR,Raetsep MT,et al.Placental growth factor deficiency is associated with impaired cerebral vascular development in mice[J].Mol Hum Reprod,2016,22(2):130-142.

[23] 張瓊,林春穎,肖保國,等.缺血性腦卒中患者急性期血漿胎盤生長因子水平及其與NEW-TOAST病因學分型相關性的研究[J].中國臨床神經(jīng)科學,2014,22(1):75-80.