胡麗 由振東 李澎 金紅陽(yáng) 黃流清

細(xì)胞型朊蛋白(Cellular prion protein,PrPC)是在正常人體內(nèi)表達(dá)的一種細(xì)胞膜蛋白，可表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)與淋巴系統(tǒng)等多個(gè)組織系統(tǒng)，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為豐富。目前研究發(fā)現(xiàn)，它可能具有多種的生理功能，如參與細(xì)胞黏附及跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡與分化、抗氧化應(yīng)激等過(guò)程；還可能與睡眠、記憶以及神經(jīng)發(fā)育與保護(hù)有關(guān)[1]。淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein,Aβ)是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precusor protein,APP)代謝產(chǎn)生，有研究發(fā)現(xiàn)小鼠腦組織間液中Aβ水平與睡眠-覺(jué)醒周期之間存在相關(guān)性[2]。此外，有研究者提出PrPC可通過(guò)調(diào)節(jié)BACE1的活性而影響APP的代謝分解過(guò)程[3]。因此，本研究檢測(cè)正常晝夜節(jié)律小鼠腦組織內(nèi)PrPC表達(dá)的晝夜周期變化規(guī)律，并進(jìn)一步檢測(cè)睡眠剝奪后海馬內(nèi)PrPC與Aβ表達(dá)水平變化,旨在探討PrPC在睡眠剝奪誘導(dǎo)的認(rèn)知功能損害中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

(1)雄性C57BL/6小鼠(6周，第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)按體重大小排序，完全隨機(jī)分為6組：建立正常睡眠一覺(jué)醒周期1周，以開(kāi)燈時(shí)間(08∶00)為起點(diǎn)，每隔4 h，共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為CT0、CT4、CT8、CT12、CT16、CT20(n=8)；自由獲取食物和水。每天08∶00點(diǎn)開(kāi)燈，20∶00點(diǎn)熄燈(12 h光照，12 h黑暗)；保持環(huán)境溫度22～24 ℃，濕度50%～60%；(2)按體重大小隨機(jī)分成睡眠剝奪組、環(huán)境對(duì)照組、正常對(duì)照組(n=6)。睡眠實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周，建立正常晝夜節(jié)律。在進(jìn)行睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)之前讓小鼠在水平臺(tái)上適應(yīng)1周，每天適應(yīng)1 h。

1.2 快速眼動(dòng)睡眠剝奪

采用改良多平臺(tái)睡眠剝奪法進(jìn)行持續(xù)72h的快速眼動(dòng)睡眠剝奪[4]。睡眠剝奪組使用的睡眠剝奪水槽(41 cm×34 cm×16.5 cm)包含12個(gè)水平臺(tái)(平臺(tái)直徑3 cm，高度5 cm)，各個(gè)平臺(tái)之間間隔3 cm；小鼠在平臺(tái)上可自由活動(dòng)，正常獲取食物和飲水；水槽內(nèi)水平面位于平臺(tái)平面下1 cm處，小鼠通過(guò)四肢抓站在平臺(tái)上，進(jìn)入REM期睡眠時(shí)四肢肌張力降低觸水即醒，從而實(shí)現(xiàn)REM期睡眠剝奪。環(huán)境對(duì)照組使用大平臺(tái)，大平臺(tái)直徑足夠大，小鼠可以在上面睡覺(jué)。正常對(duì)照組的小鼠飼養(yǎng)在鼠籠中。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

分別于6個(gè)設(shè)定時(shí)間斷頭處死小鼠，分離出海馬、皮層在預(yù)冷PBS(0.01 mol/L,pH 7.0～7.2)中勻漿，離心后取上清；標(biāo)本準(zhǔn)備完畢后開(kāi)始進(jìn)行ELISA測(cè)驗(yàn)；朊蛋白檢測(cè)試劑盒(SEB680Mu 96T)和Aβ1-42檢測(cè)試劑盒(CEA946Mu 96T)都購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)CLOUD-CLONE公司?；静僮髁鞒蹋杭訕?、孵育、洗滌、加酶結(jié)合物、洗滌、顯色、終止后自動(dòng)酶標(biāo)儀讀值(OD490)及判定。

1.4 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

于72 h睡眠剝奪后斷頭處死小鼠，分離出海馬在加入蛋白酶抑制劑cocktail(Roche公司，瑞士)的組織裂解液(武漢谷歌生物科技有限公司，中國(guó)武漢)中勻漿，然后離心，取上清；將上清與上樣緩沖液混勻，煮沸15 min，使用SDS-PAGE凝膠電泳以12%分離膠電泳分離；然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；10%的脫脂奶封閉后，加入一抗抗prp抗體(EP1802Y:1∶10000，Abcam公司，英國(guó))，4 ℃孵育過(guò)夜；二抗室溫孵育1 h，最后用化學(xué)發(fā)光法曝光；條帶的OD值用Image-J 2x圖像分析軟件測(cè)定，并使用GAPDH為內(nèi)參。

1.5 余弦法生物節(jié)律分析

采用Halberg余弦節(jié)律分析法進(jìn)行生物節(jié)律分析[5]，即用余弦函數(shù)擬合周期性變化的時(shí)序數(shù)據(jù)。其擬合函數(shù)是y(t)=M+Acos(wt+ψ),式中M(Mesor)是中值，A(Amplitude)是振幅,ω是角頻率ω=π(π是周期，t是采樣時(shí)間，ψ是峰值時(shí)相)。一般情況下P≤0.05，則證明確實(shí)存在節(jié)律性，A/M比率越高，節(jié)律性越強(qiáng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(χ±SEM)表示，按時(shí)間節(jié)點(diǎn)獲得數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，睡眠剝奪后組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較用LSD-T檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 海馬與皮層PrPC與Aβ表達(dá)水平的晝夜節(jié)律變化

C57B6/L小鼠24 h正常睡眠-覺(jué)醒周期中的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬與皮層Aβ表達(dá)水平發(fā)生具有明顯差異的波動(dòng)性變化(F=3.247，P<0.05)，而組間無(wú)明顯差異(F=1.269，P>0.05)。其中,海馬Aβ表達(dá)水平于睡眠期間CT4(12∶00)達(dá)到低谷，而后逐漸升高，覺(jué)醒時(shí)保持相對(duì)穩(wěn)定水平。海馬與皮層PrPC水平均于夜間出現(xiàn)短暫高峰期，分別是CT20(4∶00)與CT16(24∶00)，但是此變化無(wú)明顯差異(F=1.314，P>0.05)。單余弦分析顯示海馬Aβ表達(dá)水平具有晝夜節(jié)律變化(F=26.72,P<0.05)，皮層Aβ表達(dá)水平波動(dòng)性變化無(wú)明顯晝夜節(jié)律性(F=1.885,P>0.05)；PrPC在皮層具有晝夜節(jié)律性 (F=11.22,P<0.05)，海馬PrPC表達(dá)水平波動(dòng)性變化無(wú)明顯晝夜節(jié)律性(F=6.232,P>0.05)(圖1～2)。

2.2 睡眠剝奪后海馬PrPC與Aβ表達(dá)水平的變化

睡眠剝奪后睡眠剝奪組海馬PrPC的表達(dá)水平(0.22±0.05)較正常對(duì)照組(0.64±0.16)和環(huán)境對(duì)照組(0.58±0.09)明顯下調(diào)(F=4.366，P<0.05)。睡眠剝奪組Aβ的表達(dá)水平(13.03±0.71)較正常對(duì)照組(8.22±0.8)和環(huán)境對(duì)照組(8.6±0.57)明顯上調(diào)(F=14.511,P<0.05)(表1～2、圖3～4)。

3 討 論

晝夜節(jié)律是指人體生命活動(dòng)以24 h為周期的動(dòng)態(tài)變化，其產(chǎn)生的基礎(chǔ)是生物鐘基因的晝夜節(jié)律性表達(dá)。人體許多生命活動(dòng)如激素分泌、細(xì)胞分化與凋亡、睡眠活動(dòng)等都存在晝夜節(jié)律性[6-7]。哺乳動(dòng)物的晝夜節(jié)律有多種生物鐘基因來(lái)調(diào)控，這些生物鐘基因主要位于下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)。

體內(nèi)許多組織代謝、功能、蛋白表達(dá)等生命活動(dòng)都具有晝夜節(jié)律性。PrPC是在正常人體內(nèi)表達(dá)的一種細(xì)胞膜蛋白，可表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)與淋巴系統(tǒng)等多個(gè)組織系統(tǒng)，它可能具有多種生理功能，有研究者提出PrPC的表達(dá)跟睡眠之間存在關(guān)聯(lián)，也可能具有晝夜節(jié)律性。有人對(duì)此進(jìn)行了初步探討。Tobler等對(duì)體內(nèi)PrPC基因敲除小鼠進(jìn)行睡眠監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠比較，基因敲除小鼠的睡眠結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，出現(xiàn)顯著地睡眠片段化,覺(jué)醒次數(shù)增多以及非快速動(dòng)眼睡眠期(non-REM sleep,NREMS)周期縮短[8-9]。Cagampang等利用放射自顯影技術(shù)檢測(cè)大鼠前腦組織內(nèi)(視交叉上核、頂葉皮層、尾狀殼核等)PrPCmRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，PrPCmRNA表達(dá)水平在CT14或ZT14出現(xiàn)短暫高峰期，而且高峰期的出現(xiàn)與覺(jué)醒的增加無(wú)關(guān), 提示體內(nèi)PrPCmRNA表達(dá)水平可能存在晝夜節(jié)律變化[10]。臨床上也觀察到，很多研究發(fā)現(xiàn)致死性家族性失眠患者大部分生理節(jié)律發(fā)生較大變化[11-12]，因此提出PrPC與睡眠-覺(jué)醒以及睡眠結(jié)構(gòu)之間存在相關(guān)性。本研究采用ELISA方法檢測(cè)小鼠海馬、頂葉皮層PrPC表達(dá)水平，使用單余弦分析顯示頂葉皮層PrPC表達(dá)水平具有晝夜節(jié)律變化，PrPC的表達(dá)水平在CT16出現(xiàn)短暫高峰期。這進(jìn)一步佐證了小鼠皮層PrPC的表達(dá)水平具有晝夜節(jié)律變化。

圖1 海馬、皮層PrPC和Aβ在24 h正常睡眠-覺(jué)醒周期實(shí)際表達(dá)水平變化 CT0為開(kāi)燈時(shí)間(08∶00)

圖2 PrPC和Aβ在皮層和海馬的余弦擬合曲線 CT0為開(kāi)燈時(shí)間(08∶00)

圖3 72 h睡眠剝奪后海馬PrPC表達(dá)水平變化 與正常對(duì)照組和環(huán)境對(duì)照組比較,*P<0.05

圖4 72 h睡眠剝奪后海馬Aβ表達(dá)水平變化 與正常對(duì)照組和環(huán)境對(duì)照組比較,*P<0.01

表1 睡眠剝奪后海馬PrPC表達(dá)水平變化

注：與正常對(duì)照組和環(huán)境對(duì)照組比較，*P<0.05

表2 睡眠剝奪后海馬Aβ表達(dá)水平變化

注：與正常對(duì)照組和環(huán)境對(duì)照組比較，*P<0.05

睡眠是人體必不可少的生命活動(dòng)，并在大腦功能活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，尤其是認(rèn)知功能，可促進(jìn)大腦內(nèi)神經(jīng)毒性代謝產(chǎn)物的清除以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)突觸的形成與維護(hù)[13-14]。目前研究已證實(shí)睡眠剝奪可誘導(dǎo)認(rèn)知功能損害，特別是海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶顯著損害[15-16]。Aβ是APP在β-分泌酶(β-secretase 1，BACE1)作用下分解代謝產(chǎn)生，機(jī)體內(nèi)Aβ的產(chǎn)生和清除之間存在相對(duì)平衡，這個(gè)平衡的破壞可能是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制—Aβ在胞外沉積形成老年斑是AD發(fā)病的主要病理過(guò)程。Kang等通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Aβ的產(chǎn)生和清除與睡眠-覺(jué)醒周期之間有密切關(guān)系—胞外Aβ在覺(jué)醒期呈現(xiàn)高水平，睡眠期呈現(xiàn)低水平，急性睡眠剝奪后Aβ表達(dá)水平升高[17]。本研究檢測(cè)正常小鼠海馬和皮層內(nèi)Aβ表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)24 h正常睡眠-覺(jué)醒周期中Aβ表達(dá)水平發(fā)生具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的波動(dòng)性變化。單余弦分析顯示海馬內(nèi)Aβ表達(dá)水平具有晝夜節(jié)律變化，余弦曲線顯示海馬內(nèi)Aβ的表達(dá)水平在睡眠期呈現(xiàn)低水平，而在覺(jué)醒期呈現(xiàn)高水平，這與目前的研究基本相符。在此基礎(chǔ)上本研究進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)72 hREM期睡眠剝奪后海馬Aβ表達(dá)水平升高,這可能與睡眠剝奪后認(rèn)知功能損害有密切關(guān)聯(lián)。目前，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)PrPC可通過(guò)作用于關(guān)鍵酶BACE1，調(diào)節(jié)APP的分解，從而影響Aβ的產(chǎn)生[18-19]。結(jié)合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪后海馬PrPC表達(dá)水平下調(diào), Aβ表達(dá)水平升高。PrPC基因敲除小鼠腦組織內(nèi)Aβ表達(dá)水平明顯高于野生型小鼠[20]。因此，本研究推測(cè)睡眠剝奪誘導(dǎo)認(rèn)知功能損害機(jī)制，即由于睡眠剝奪后PrPc表達(dá)下調(diào)而對(duì)BACE1的抑制作用減弱，使APP分解產(chǎn)生Aβ增多，進(jìn)而引起認(rèn)知功能損害。

基于腦組織內(nèi)PrPC表達(dá)水平存在晝夜周期規(guī)律變化，睡眠剝奪后海馬PrPC與Aβ表達(dá)水平變化提示PrPC在睡眠剝奪誘導(dǎo)的認(rèn)知功能損害中可能起到影響Aβ表達(dá)的橋接作用，有望成為AD治療的新靶點(diǎn)之一，值得進(jìn)一步研究。

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