楊慧慈 江曉霞 張建 張庭華 周立成 張淳

【摘 要】目的：優(yōu)化GST-hEGF融合蛋白工程菌pGEX-EGF/BL21STAR（DE3）pLysS 30L發(fā)酵罐培養(yǎng)及表達(dá)條件。方法：上罐發(fā)酵采用M9-YT-Glu發(fā)酵培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)；通過(guò)還原SDS-PAGE法測(cè)定目標(biāo)蛋白表達(dá)量、落計(jì)數(shù)法測(cè)定質(zhì)粒丟失率，以確定表達(dá)溫度、時(shí)間以及IPTG添加量等參數(shù)。結(jié)果與討論：hEGF重組菌誘導(dǎo)溫度為30℃、加入終濃度0.2M IPTG誘導(dǎo)，維持誘導(dǎo)時(shí)間4hr，目的蛋白表達(dá)量占菌體蛋白總量的30%左右，為后續(xù)rEGF融合蛋白純化奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】人表皮生長(zhǎng)因子；融合蛋白；發(fā)酵條件優(yōu)化

【中圖分類(lèi)號(hào)】R786 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-6851（2018）04-0-01

人表皮生長(zhǎng)因子（hEGF）由Cohen等人于1975年從人體尿液中分離得到，又被稱(chēng)為抑胃素（Urogastrone）[1]。hEGF在多種疾?。ㄈ缃悄p傷和糖尿病足等）的治療中體現(xiàn)出顯著的效果[2]，其藥用開(kāi)發(fā)具有巨大的潛力；同時(shí)，EGF在美容方面的功效已被消費(fèi)者廣泛認(rèn)可，相關(guān)產(chǎn)品的市場(chǎng)需求日益增大。然而，天然提取高活性EGF售價(jià)近200萬(wàn)美元/克，提取效率極低，無(wú)法大規(guī)模工業(yè)化制備，高質(zhì)量EGF原料的生產(chǎn)供應(yīng)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。因此，開(kāi)發(fā)一種高效的EGF生產(chǎn)工藝不僅具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也為EGF進(jìn)一步應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供了最基本的保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。pGEX-EGF/BL21STAR（DE3）工程菌由臨沂大學(xué)藥學(xué)院構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基。（1）LB液體培養(yǎng)基：1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0% NaCl，pH 7.0，121℃滅菌20 min ；（2）LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中補(bǔ)加1.0%瓊脂；（3）含氨芐青霉素的LB（LA）液體（或固體）培養(yǎng)基：待LB液體（或固體）培養(yǎng)基滅菌后降溫至50℃以下，加入氨芐青霉素（100 μg/mL）；（4）M9-YT-Glu發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5%胰蛋白胨，0.3%酵母提取物，0.06%NaCl，0.5%KH2PO4，3%Na2HPO4·12H2O，1%葡萄糖，0.1%MgSO4，0.1%NH4Cl；（5）補(bǔ)料培養(yǎng)基：30%葡萄糖，5%胰蛋白胨，3%酵母提取物。

1.1.3 主要試劑。胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，中分子量蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自天根生化科技有限公司，IPTG購(gòu)自索萊寶，無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖等購(gòu)自上海生工。

1.1.4 主要儀器設(shè)備。HSX-150恒溫恒濕箱，上海申賢恒溫設(shè)備廠； HNY恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；ChampGel 5000數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 菌密度測(cè)定。用紫外可見(jiàn)光光度法測(cè)定發(fā)酵液600nm波長(zhǎng)時(shí)光吸收值[3]，以未接種培養(yǎng)基作參比。

1.2.2 目標(biāo)蛋白表達(dá)水平的測(cè)定。采用還原SDS-PAGE電泳考馬斯亮蘭染色法[4]，電泳凝膠經(jīng)掃描后分析重組蛋白占菌體總蛋白的百分含量。

1.2.3 質(zhì)粒丟失率的檢測(cè)方法。將待測(cè)發(fā)酵液測(cè)OD600值，以無(wú)菌水稀釋?zhuān)古囵B(yǎng)液均達(dá)到OD600為0.2。然后取200μl涂LB平板，37℃培養(yǎng)48hr。從培養(yǎng)好的LB平板上挑一單菌落同時(shí)轉(zhuǎn)接到LB和LA平板上，37℃培養(yǎng)48hr。計(jì)算菌落數(shù)，LB平板上的菌落數(shù)為M，LA平板上的菌落數(shù)為N，則丟失率計(jì)算方法為（M-N）/M×100%。

1.2.4 工程菌的培養(yǎng)方法（30升發(fā)酵罐規(guī)格）。（1）種子菌的活化：取-80℃，12.5%甘油保存的生產(chǎn)種子庫(kù)菌種，劃線接種于含氨芐（100μg/ml）的LB斜面，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑菌苔于含氨芐（100μg/ml）LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振搖培養(yǎng)至OD600 為0.4-0.5時(shí)，作為活化種子4℃保存。（2）種子液培養(yǎng)：取活化種子，以1：100接種于400ml LB培養(yǎng)基中，30℃，150rpm，培養(yǎng)15hr，作為一級(jí)種子液。再以1：10接種于2L LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃，250rpm，培養(yǎng)2hr，作為上罐種子液。（3）發(fā)酵工藝：發(fā)酵上罐培養(yǎng)基18L，培養(yǎng)基配方為 M9-YT-Glu。取種子液2000ml，加入發(fā)酵罐中，使終體積為20L。調(diào)整工藝參數(shù)：設(shè)定溫度37℃，轉(zhuǎn)速300rpm，pH用50%氨水自動(dòng)調(diào)至7.0。當(dāng)發(fā)酵至3-4hr，開(kāi)始流加營(yíng)養(yǎng)液。待菌體OD600達(dá)到8-12，溶氧值開(kāi)始上升時(shí)，降溫至30℃，以不同IPTG終濃度（0.1M、0.2M、0.3M ）進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間2-6小時(shí)，每1小時(shí)取1次樣品。樣品離心、作SDS-PAGE電泳，觀察蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)的影響

溫度在發(fā)酵過(guò)程中的影響一方面表現(xiàn)在工程菌產(chǎn)物合成的數(shù)量，另一方面表現(xiàn)在工程菌自身數(shù)量的增長(zhǎng)。大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為37℃，是使比生長(zhǎng)率達(dá)到最大值的溫度。將種子液以1：10接入發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)至菌體OD600達(dá)到10-12，加入終濃度為0.2M IPTG誘導(dǎo)，同時(shí)控制溫度至25℃、30℃、37℃，誘導(dǎo)時(shí)間4hr，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。

M：marker；1：37℃表達(dá)菌體；2：37℃破菌溶解上清；3：30℃表達(dá)菌體；4：30℃破菌溶解上清；

5：25℃表達(dá)菌體；6：25℃破菌溶解上清

如圖1所示，三個(gè)溫度均可見(jiàn)明顯目標(biāo)蛋白表達(dá)條帶，其中37℃和30℃對(duì)菌體數(shù)量增值及表達(dá)量明顯優(yōu)于25℃時(shí)表達(dá)量；37℃誘導(dǎo)表達(dá)后，破菌上清目標(biāo)蛋白溶解度較低，提示溫度過(guò)高影響融合蛋白可溶性表達(dá)；30℃在不明顯降低目標(biāo)蛋白表達(dá)量的同時(shí)，可溶性表達(dá)比例最高，綜上，選擇誘導(dǎo)溫度為30℃。

2.2 不同IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響

在發(fā)酵研究中，采用不同時(shí)間的多點(diǎn)抽樣，測(cè)定其菌體OD600值，逐點(diǎn)用計(jì)算機(jī)描繪出菌體生長(zhǎng)曲線，當(dāng)工程菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期（約4hr），降溫至30℃，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，hEGF蛋白表達(dá)量可達(dá)30%左右。而IPTG作為一種不消耗的誘導(dǎo)物，僅需維持一定的濃度即可持續(xù)誘導(dǎo)。所以，本實(shí)驗(yàn)篩選了終濃度分別為0.1M、0.2M和0.3M的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.對(duì)照；2.0.1M IPTG；3.0.2M IPTG； 4.0.3M IPTG

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示：除0.1M IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)量為20%外，其余兩種IPTG濃度誘導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)量均為31%以上，無(wú)較大差別。三種不同IPTG濃度誘導(dǎo)獲得的目標(biāo)蛋白破菌溶解性無(wú)較大差異。綜合考慮到成本和工藝的穩(wěn)定性，rEGF發(fā)酵IPTG終濃度選擇0.2M。

2.3 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 不同誘導(dǎo)時(shí)間質(zhì)粒丟失率測(cè)定 分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr取發(fā)酵液測(cè)定發(fā)酵液上清中乙酸的含量，并通過(guò)平板培養(yǎng)法計(jì)算不同誘導(dǎo)時(shí)間的質(zhì)粒的丟失率。結(jié)果如表1、圖3所示。

2.3.3 不同誘導(dǎo)時(shí)間蛋白表達(dá)量測(cè)定 分別取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr的發(fā)酵液樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，灰度掃描，并分析誘導(dǎo)時(shí)間與蛋白表達(dá)量之間的關(guān)系。結(jié)果如圖4所示：①誘導(dǎo)時(shí)間為1hr時(shí)的目的蛋白表達(dá)量為12%；2hr為18%；3hr為25%；4hr為30%；5hr為28.5%；6hr為28.0%。即隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)量呈先增加后降低的趨勢(shì)，且4hr以后蛋白表達(dá)量趨于基本穩(wěn)定。②誘導(dǎo)4hr后，質(zhì)粒丟失率為40%，5hr以后質(zhì)粒丟失顯著增加，達(dá)到68%，即4hr以后質(zhì)粒丟失率加快，穩(wěn)定性降低。

3 結(jié)論與討論

rEGF工程菌的發(fā)酵，選擇M9-YT-Glu鹽培養(yǎng)基作為生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，維持溶氧不低于30%，當(dāng)菌體密度OD600=10-12時(shí)，降低溫度為30℃并加入終濃度0.2M IPTG誘導(dǎo)，維持誘導(dǎo)時(shí)間4hr，最終菌體密度均可達(dá)到OD600值20以上，目的蛋白表達(dá)量占菌體蛋白總量的30%左右，為后續(xù)rEGF融合蛋白純化奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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