石小倩 高潔 張海娟 趙志龍 董芳 修婷 魏英煥 史曉委

【摘 要】目的：分析中華絨螯蟹乙酰膽堿酯酶的免疫調(diào)節(jié)作用。方法：利用LPS和TNF-α 作為免疫激活因子，刺激中華絨螯蟹的免疫系統(tǒng)，然后檢測被激活的免疫系統(tǒng)對中華絨螯蟹乙酰膽堿酯酶的表達(dá)水平和酶活力的影響。結(jié)果：LPS和TNF-α 可顯著提高中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞中AChE基因的表達(dá)水平和血淋巴上清液中ACh的濃度。結(jié)論：中華絨螯蟹乙酰膽堿酯酶在其免疫應(yīng)答反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用。

【關(guān)鍵詞】中華絨螯蟹；乙酰膽堿酯酶；LPS；TNF-α

【中圖分類號】R412 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）04-0-01

乙酰膽堿酯酶（AChE； EC 3.1.1.7）能催化分解乙酰膽堿，是膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分。在脊椎動物中，乙酰膽堿酯酶可以通過控制血清中乙酰膽堿的濃度，來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[1]，而關(guān)于乙酰膽堿酯酶在無脊椎動物中的免疫調(diào)節(jié)研究相對較少。目前，已有研究表明乙酰膽堿酯酶廣泛存在于無脊椎動物膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)中，且在扇貝等軟體動物中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用[2]。本研究擬利用LPS和TNF-α 刺激中華絨螯蟹，檢測中華絨螯蟹血淋巴中乙酰膽堿酯酶基因的時序表達(dá)變化規(guī)律及血淋巴中乙酰膽堿濃度的時序變化，本研究可進(jìn)一步豐富無脊椎動物膽堿能神經(jīng)免疫的內(nèi)容。

1 儀器和試劑

高壓滅菌鍋（上海申安）、超低溫冰箱（中科美菱）、高速冷凍離心機（艾本德）、溫度梯度PCR儀（艾本德）、實時熒光定量PCR儀（羅氏LC96）、酶標(biāo)儀（伯騰）、脂多糖LPS（Sigma，0.5 mg/mL）、腫瘤壞死因子-α（Sigma，乙酰膽堿檢測試劑盒（Abnova）、RNA提取試劑盒（Invitrogen）、dNTP（Promega）、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（寶生物）等。

2 實驗方法

2.1 LPS免疫刺激實驗 于五月份準(zhǔn)備280重量平均為 50 ± 5 g 的中華絨螯蟹，隨機選取120只作為 LPS 刺激組，另取 120 只作為對照組，剩余 40 只作為空白組，分別作如下處理：

LPS 刺激組：每只注射 50 μL LPS（0.5 mg/ml，in PBS）

對照組：每只注射滅菌 50 μL PBS

空白組：不做任何處理

注射后的 LPS 刺激組和對照組中的中華絨螯蟹立即放回養(yǎng)殖桶，同時隨機取樣 15 只空白組中的中華絨螯蟹。在注射后 3、6、12、24、48 和 96 小時，分別在 LPS 刺激組和對照組中隨機取樣15只中華絨螯蟹。從取樣的中華絨螯蟹中抽取血淋巴，并將三只中華絨螯蟹的血淋巴混在一起，作為一份樣品。800 g 4 °C 離心血淋巴 10 min，留血淋巴細(xì)胞用于提取總 RNA，留血淋巴上清液用于檢測乙酰膽堿濃度變化。

2.2 TNF-α免疫刺激實驗 2.10櫛孔扇貝的 TNF-α 刺激實驗。于五月份準(zhǔn)備 280 只平均重量為 50 ± 5 g 的中華絨螯蟹，隨機選取120只作為 TNF-α 刺激組，另取 120 只作為對照組，剩余 40 只作為空白組，分別作如下處理：

TNF-α 刺激組：每只注射 50 μL TNF-α（50 ng/mL，in PBS）

對照組：每只注射滅菌 50 μL PBS

空白組：不做任何處理

注射后的 TNF-α 刺激組和對照組中的中華絨螯蟹立即放回養(yǎng)殖桶，同時隨機取樣 15 只空白組中的中華絨螯蟹。在注射后 3、6、12、24、48 和 96 小時，分別在TNF-α 刺激組和對照組中隨機取樣15只中華絨螯蟹。從取樣的中華絨螯蟹中抽取血淋巴，并將三只中華絨螯蟹的血淋巴混在一起，作為一份樣品。800 g 4 °C 離心血淋巴 10 min，留血淋巴細(xì)胞用于提取總 RNA，留血淋巴上清液用于檢測乙酰膽堿濃度變化。

2.3 中華絨螯蟹血淋巴中 ACh 的濃度測定 ACh 測定采用 Abnova 公司生產(chǎn)的 ACh 試劑盒（KA1624）。乙酰膽堿可以 被乙酰膽堿酯酶催化為膽堿和乙酸，膽堿在膽堿氧化酶的催化下生成甜菜堿和過氧化氫，過氧化氫能與一種特殊的染料形成粉紅色產(chǎn)物。這種粉紅色產(chǎn)物在 570 nm 下的光密度值，跟乙酰膽堿的濃度成正比。

2.4 中華絨螯蟹總 RNA 的提取 無菌條件下采集中華絨螯蟹血淋巴樣品，于 800 g 4 °C離心 10 min 后收集血淋巴細(xì)胞，加入 1 mL RNAiso plus，迅速用 5 mL 注射器快速吸打破壞血淋巴細(xì)胞；然后每 1 mL RNAiso plus 加入 0.2 mL 預(yù)冷氯仿，用力振蕩 2 min，12，000 g 4℃離心 15 min；離心后，混合物分為上層 RNA 無色水相，中間變性蛋白層和下層淡紅色有機相；將上層 RNA 無色水相移至 1.5 mL 離心管中，加入等體積異丙醇放置于-80 °C超低溫冰箱中 10 min，12，000 g 4 °C離心 15 min以沉淀RNA；然后加1 mL 75% 的乙醇洗滌兩次。將RNA置于4°C冰箱中 沉淀干燥 5-10 min，加入 20 μL DEPC 處理水溶解；將 RNA 樣品稀釋 100 倍，在紫外分光光度計下測定 OD260 及 OD280，合格的 RNA 的 A260：A280 應(yīng)介于 1.8-2.2 之間。

3 實驗結(jié)果

3.1 LPS對中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞中乙酰膽堿酯酶時序表達(dá)變化的影響

LPS 刺激中華絨螯蟹 3、6、12、24、48 和 96 小時后，中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞中 AChE mRNA 表達(dá)水平的顯著上升，而對照組中該基因的表達(dá)水平未檢測到顯著變化。AChE mRNA 的表達(dá)水平在 LPS 刺激 24 小時顯著高于空白組和對照組中的表達(dá)水平（P < 0.05），為空白組的 7.4 倍（圖 3.1）。

3.2 TNF-α 對中華絨螯蟹血淋巴液中乙酰膽堿酯酶時序表達(dá)變化的影響

為了進(jìn)一步驗證中華絨螯蟹膽堿能信號通路響應(yīng)免疫應(yīng)答的機制，利用人 TNF-α（50.0 ng/mL）刺激中華絨螯蟹 3、6、12、24、48 和 96 小時后，中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞中 AChE mRNA 基因的表達(dá)水平呈先上升后下降的趨勢。在 TNF-α 處理 3 h、6h、12h 小時后，AChE 基因的表達(dá)水平分別是對照組的 2.2 倍（P < 0.05）、3.4 倍（P < 0.05）和 1.9 倍（P < 0.05），其中 TNF-α 刺激6 小時處，AChE 基因的表達(dá)水平達(dá)到最高值（圖 3.2）。

3.3 免疫刺激對中華絨螯蟹血淋巴液中乙酰膽堿濃度變化的影響

用 LPS 和 TNF-α 刺激中華絨螯蟹 3、6、12、24、48 和 96 小時后，采用比色法檢測中華絨螯蟹血淋巴中乙酰膽堿濃度的時序變化。中華絨螯蟹血淋巴中去乙酰膽堿濃度在LPS刺激 6 h 處達(dá)到最高值（12.36 ×10-6 M，P < 0.05）；在 其它時間點，乙酰膽堿濃度與對照組相比沒有顯著性差異（圖 3.3）。中華絨螯蟹血淋巴中的乙酰膽堿濃度在 TNF-α 刺激 3 h 后即達(dá)到最高值（13.51×10-6 M，P < 0.05），顯著高于對照組，6 h 后，乙酰膽堿濃度開始下降，但仍顯著高于對照組水平（12.56×10-6 M，P < 0.05），在 12-96 h 乙酰膽堿濃度與對照組相比沒有顯著差異（圖 3.3）。相比 LPS 刺激，中華絨螯蟹血淋巴中乙酰膽堿濃度對 TNF-α 刺激的響應(yīng)更敏感。以上結(jié)果表明，LPS 和 TNF-α 刺激顯著誘導(dǎo)了中華絨螯蟹血淋巴中乙酰膽堿濃度的上升，并且 TNF-α 刺激比 LPS 刺激效果更顯著。

4 討論與結(jié)論

已有研究表明，AChE在高等動物免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用，在低等無脊椎動物中，也有關(guān)于AChE參與免疫應(yīng)答反應(yīng)的相關(guān)報道[3]。本研究在中華絨螯蟹免疫應(yīng)答反應(yīng)過程中，免疫刺激因子 LPS 和 TNF-α 均可激活中華絨螯蟹的膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)，提高中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞中 AChE 基因的表達(dá)水平，以及提高血淋巴上清液中 ACh 濃度的變化。中華絨螯蟹被激活的膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)，將反饋調(diào)節(jié)其免疫應(yīng)答反應(yīng)，促使機體重新恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因此，中華絨螯蟹的膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)在其免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。

參考文獻(xiàn)

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Silva，A.D.，et al.，Chagas disease：modulation of the inflammatory response by acetylcholinesterase in hematological cells and brain tissue.Mol Cell Biochem，2018.438（1-2）：p.59-65.