郭春梅，劉淑清，孫明忠

(1. 大連醫(yī)科大學(xué) 生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044；2. 大連醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

微小RNA(miRNA)是一類長度大約為18～24個(gè)堿基的內(nèi)源非編碼小RNA分子，通過與靶基因3′末端非翻譯區(qū)(3′-UTR)完全或不完全互補(bǔ)配對形成沉默復(fù)合體(RISC)，導(dǎo)致mRNA降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[1-2]。miRNAs異常表達(dá)與多種疾病尤其是癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3-4]，是腫瘤診斷、治療及預(yù)后的研究熱點(diǎn)。

miR-429是miR-200家族成員之一，miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429[5]。近年來研究表明，miR-429異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、凋亡、耐藥等密切相關(guān)，但miR-429在腫瘤中所起的作用一直有爭議，具腫瘤特異性[6-8]。一個(gè)miRNA可影響多個(gè)靶基因，而一個(gè)靶基因又受多個(gè)miRNA的調(diào)控，miR-429有多個(gè)靶基因，可通過靶向作用于ZEB1、ZEB2、Sp1、BMI1、E2F3、KIAA0101、PAK6、Onecut2、SOX2、Bcl-2、BMK1、XIAP、c-myc、SP1、PTEN、RASSF8、TIMP2、DLC-1、p27Kip1、NOTCH1調(diào)節(jié)不同的信號通路來調(diào)控腫瘤的生物行為[6-10]。

信號接頭蛋白CRKL (v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homologue(avian)-like)是CRK家族成員之一，分子量為39 kDa，編碼303個(gè)氨基酸[11-12]。CRKL包含一個(gè)SH2和兩個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域，呈現(xiàn)SH2-SH3-SH3結(jié)構(gòu)形式，在兩個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域之間有一酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(Y207)[13]。CRKL是酪氨酸激酶的關(guān)鍵底物，可通過SH2、SH3結(jié)構(gòu)域招募信號通路分子，與BCAR1、GAB、ABL-1、Pax、GEF、C3G、BCR-ABL、SOS結(jié)合形成復(fù)合物參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，進(jìn)而影響細(xì)胞的分化、增殖、粘附、遷移、侵襲、凋亡等生物活動(dòng)，起著信號開關(guān)的作用[13-14]。近年來研究表明，CRKL異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、遷移、侵襲、粘附、預(yù)后、耐藥性密切相關(guān)，可能是潛在影響腫瘤治療和預(yù)后的靶標(biāo)分子[13-15]。本課題組前期研究亦表明CRKL與鼠肝癌Hca-P細(xì)胞[16]的體外遷移、侵襲、增殖、克隆形成能力相關(guān)，且CRKL在小鼠肝癌高、低淋巴道轉(zhuǎn)移力細(xì)胞株Hca-P、Hca-F中差異表達(dá)[17]，提示CRKL與腫瘤密切相關(guān)。

本研究在肝癌HepG2細(xì)胞中探討了miR-429對CRKL的靶向調(diào)控作用，驗(yàn)證了miR-429直接靶向結(jié)合于CRKL-3′-UTR第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)負(fù)性調(diào)節(jié)CRKL的表達(dá)，以及CRKL負(fù)性調(diào)控 miR-429的表達(dá)，揭示了miR-429和CRKL之間的負(fù)向調(diào)控關(guān)系，為臨床抗腫瘤靶向治療提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 生物信息學(xué)預(yù)測miR-429與CRKL的結(jié)合位點(diǎn)

應(yīng)用miRNA靶基因預(yù)測在線軟件TargetScan(http://genes.mit.edu/targetscan/)、PicTar(http://pictar.bio.nqyu.edu/)和miRanda(http://microrna.sanger.ac.uk/)，根據(jù)人源CRKL的基因編碼序列，預(yù)測miR-429與CRKL的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2 設(shè)計(jì)野生型CRKL-3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)引物

根據(jù)預(yù)測的miR-429與CRKL-3′-UTR的結(jié)合位點(diǎn)，利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增CRKL-3′-UTR包含miR-429潛在結(jié)合位點(diǎn)的片段，并根據(jù)psiCHECK-2雙熒光素報(bào)告載體上的多克隆酶切位點(diǎn)，分別在上、下游引物添加Xho I與Not I酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)記)，引物序列如下：

(1)擴(kuò)增包含兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)總片段的引物

Forward primer:5'-CTCGAGGCTCATAGTGAACACAGCAGACCTAGAAATGTAGC-3'

Reverse primer:5'-GCGCGGCCGCCGGCTGATGCAAGTTTTATTGAGACAATAT-3'

(2)擴(kuò)增第1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的引物

Forward primer:5'-CTCGAGGCTCATAGTGAACACAGCAGACCTAGAAATGTAGC-3'

Reverse primer:5'-TAGCGGCCGCTAAAGGGCAAACACTGTTTCTAGGCAG-3'

(3)擴(kuò)增第2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的的引物

Forward primer:5'-CTCGAGGGGATGATGTGGTTTTTTGCCAGGTGTTTATAAT-3'

Reverse primer:5'-GCGGCCGCCGGCTGATGCAAGTTTTATTGAGACAATAT-3'

1.3 設(shè)計(jì)突變型CRKL-3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)引物

根據(jù)定點(diǎn)突變PCR法對CRKL-3′-UTR兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)突變引物，引物序列如下(下劃線表示酶切位點(diǎn)，波浪線表示突變堿基)。

(1)突變第1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的引物

1)突變上游片段引物

Forward primer:5'-CTCGAGGCTCATAGTGAACACAGCAGACCTAGAAATGTAGC-3'

Reverse primer:5'-TTCATGAATACAGCAGTTATCTGCCTGATGGTAATCACATTTAAAG-3'

2)突變下游片段引物

Forward primer:5'-CTTTAAATGTGATTACCATCAGGCAGATAACTGCTGTATTCATG-3'

Reverse primer:5'-TAGCGGCCGCTAAAGGGCAAACACTGTTTCTAGGCAG-3'

(2)突變第2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的引物

1)突變上游片段引物

Forward primer:5'-CTCGAGGGGATGATGTGGTTTTT-3'

Reverse primer:5'-ACACTCGATGTATTCTAAGAATATAAGTCATTATTATCACTTAATTTTATAGCAC-3'

2)突變下游片段引物

Forward primer:5'-GTGCTATAAAATTAAGTGATAATAATGACTTATATTCTTAGAATACATCGAGTG-3'

Reverse primer:5'-GCGCGGCCGCCGGCTGATGCAAG-3'

1.4 構(gòu)建野生型及突變型雙熒光素重組表達(dá)載體

構(gòu)建野生型pMDT-19-CRKL-3'-UTR-WT、突變型pMDT-19-CRKL-3'-UTR-MUT克隆重組載體，以及野生型psiCHECK2-CRKL-3'-UTR-WT(包含miR-429與CRKL-3′-UTR兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的序列，簡稱WT)、psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT1(包含miR-429與CRKL-3′-UTR第1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的序列，簡稱WT1)、 psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT2(包含miR-429與CRKL-3′-UTR第2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的序列，簡稱WT2)、突變型psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT1(包含miR-429與CRKL-3′-UTR第1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的突變序列，簡稱MUT1)、 psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT2(包含miR-429與CRKL-3′-UTR第2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的突變序列，簡稱MUT2)雙熒光素重組表達(dá)載體。

1.5 雙熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，將1×105個(gè)細(xì)胞/孔均勻鋪于24孔板，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；將實(shí)驗(yàn)分WT、WT1、WT2、MUT1和MUT2組。1.5 μg psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT、psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT1、 psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT2、psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT1、 psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT2重質(zhì)粒分別與50 mol/L miR-429 mimics或miR-429-NC瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染步驟按照LipofectamineTM2000說明書操作；轉(zhuǎn)染48 h后，采用promega的luciferase試劑盒進(jìn)行檢測，將100 μL裂解液PLB(Passive Lysis Buffer)加到24孔板中，室溫溫育15 min后吹打細(xì)胞；將20 μL細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到黑色96孔板中，再加入50 μL LAR II(Luciferase Assay Reagent)混勻，放入酶標(biāo)儀中檢測螢火蟲熒光素酶活性；向檢測管中加入100 μL Stop試劑，檢測海腎熒光素酶活性，海腎熒光素酶活性測得的數(shù)值/螢火蟲熒光素酶活性測得的數(shù)值即為每組細(xì)胞的相對熒光素活性。

1.6 qRT-PCR測定

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-429模擬物及其NC、miR-429抑制劑及其NC至HepG2細(xì)胞中，各組分別命名為HepG2-miR-429、HepG2-miR-NC、HepG2-LNA-miR-429、HepG2-LNA-miR-NC，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，檢測miR-429上、下調(diào)對內(nèi)源性CRKL mRNA表達(dá)水平的影響。前期我們篩選到了CRKL表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細(xì)胞株HepG2-shCRKL及其陰性對照組單克隆細(xì)胞株HepG2-shNC、以及CRKL表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)的細(xì)胞株HepG2-PCDH-CRKL及其對照組細(xì)胞株HepG2-PCDH，細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集各組細(xì)胞，檢測CRKL表達(dá)上、下調(diào)對miR-429表達(dá)水平的影響。Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。利用Applied Biosystems StepOneTMReal-Time PCR Systems系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，采用2-ΔΔCt法ACTB作為內(nèi)參計(jì)算CRKL mRNA的相對表達(dá)水平，U6作為內(nèi)參計(jì)算miR-429的相對表達(dá)水平。ACTB：F primer 5′-AGGCCAACCGCGAGAAG-3′, R primer 5′-ACAGCCTGGATAGCAACGTACA-3′; CRKL: F primer 5′-GTGCTTATGACAAGACTGCCT-3′, R primer 5′-CACTCGTTTTCATCTGGGTTT-3′。

1.7 Western blot (WB) 測定

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-429模擬物及其NC、miR-429抑制劑及其NC至HepG2細(xì)胞中72 h后，分別收集HepG2-miR-429、HepG2-miR-NC、HepG2-LNA-miR-429、HepG2-LNA-miR-NC各組細(xì)胞，檢測miR-429上、下調(diào)對內(nèi)源性CRKL蛋白表達(dá)水平的影響。RIPA buffer (50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS in the presences of 1 mmol/L Na3VO4, 1 μg/mL leupeptin and 0.5 mmol/L PMSF)提取細(xì)胞總蛋白，10%SDS-PAGE電泳后蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，一抗、二抗孵育后，ECL發(fā)光液顯影，利用凝膠成像系統(tǒng)軟件Image Lab software 4.0.1分析CRKL/ACTB相對灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)分析，P≤ 0.05表示具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 預(yù)測miRNA的靶基因

通過在線軟件預(yù)測miR-429調(diào)控的靶基因，發(fā)現(xiàn)TargetScan、PicTar和miRanda軟件均預(yù)測出CRKL，CRKL可能是miR-429的潛在靶基因。miR-429與CRKL-3′-UTR存在兩處結(jié)合位點(diǎn)，如圖1所示。為證實(shí)CRKL是miR-429的直接靶基因，首先擴(kuò)增了CRKL-3′-UTR區(qū)包含miR-429結(jié)合位點(diǎn)的序列，構(gòu)建了野生型的雙熒光素酶報(bào)告載體，為證明確實(shí)是miR-429作用預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致熒光素酶活性發(fā)生改變，又突變了CRKL-3′-UTR區(qū)包含miR-429結(jié)合位點(diǎn)的序列并構(gòu)建了突變型雙熒光素重組表達(dá)載體。

圖1 miR-429與CRKL-3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)Fig 1 Putative binding sites for miR-429 at CRKL-3′-UTR

2.2 雙熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-429與CRKL-3′-UTR靶向結(jié)合

構(gòu)建好野生型psiCHECK2-CRKL-3'-UTR-WT及突變型psiCHECK2-CRKL-3'-UTR-MUT重組表達(dá)載體后，通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)(圖2)：與miR-NC相比，miR-429與psiCHECK-2-CRKL-3-UTR-WT共轉(zhuǎn)染后使熒光素酶活性下降了(45.7±1.1)%(P=0.004)；miR-429與WT2共轉(zhuǎn)染后使熒光素酶活性下降了(37.0±0.8)%(P=0.0008)，當(dāng)這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)被突變后，miR-429對熒光素酶活性的抑制作用基本被消除；而miR-429與WT1、MUT1共轉(zhuǎn)染后對熒光素酶活性沒影響。說明CRKL是miR-429的靶基因，miR-429主要靶向CRKL-3′-UTR第2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)抑制CRKL的表達(dá)。

**兩組間比較，P<0.01; ***兩組間比較，P<0.001圖2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測miR-429與CRKL-3′-UTR區(qū)結(jié)合Fig 2 Interaction between miR-429 and CRKL-3′-UTR detected with luciferase activity assay

2.3 miR-429負(fù)性調(diào)控CRKL的表達(dá)

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-429模擬物及其NC、miR-429抑制劑及其NC至HepG2細(xì)胞中48 h后， HepG2-miR-429中的miR-429表達(dá)比HepG2-miR-NC上調(diào)了(6373600±10220)%(P=0.0034)(圖3A)；HepG2-LNA-miR-429中的miR-429表達(dá)比HepG2-LNA-miR-NC下調(diào)了(76.2±3.7)%(P=0.0103)(圖3B)。而HepG2-miR-429中的內(nèi)源性CRKL 蛋白表達(dá)比HepG2-miR-NC下調(diào)了(55.0±1.5)%(P=0.0089)(圖3C)，HepG2-LNA-miR-429中的內(nèi)源性CRKL 蛋白表達(dá)比HepG2-LNA-miR-NC上調(diào)了(44.3±1.0)%(P=0.0038)(圖3D)。但HepG2-miR-429及HepG2-LNA-miR-429與各自nc組比較其內(nèi)源性CRKL mRNA 表達(dá)變化不大(圖3C、D)。

*兩組間比較，P<0.05; **兩組間比較，P<0.01A：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-429模擬物上調(diào)miR-429的表達(dá)；B：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-429抑制劑下調(diào)miR-429的表達(dá)；C：miR-429上調(diào)抑制內(nèi)源性CRKL蛋白表達(dá)；D：miR-429下調(diào)促進(jìn)內(nèi)源性CRKL蛋白表達(dá)圖3 miR-429對內(nèi)源性CRKL表達(dá)的影響Fig 3 Effect of miR-429 on endogenous CRKL expression

2.4 CRKL負(fù)性調(diào)控miR-429的表達(dá)

G418有限稀釋法篩選得到了CRKL表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的單克隆細(xì)胞株HepG2-shCRKL及其陰性對照組單克隆細(xì)胞株HepG2-shNC，與HepG2-shNC相比，HepG2-shCRKL細(xì)胞中CRKL 蛋白表達(dá)水平降低了(97.0±0.6)%(P<0.0001)(圖4A)。通過慢病毒轉(zhuǎn)染篩選得到了CRKL表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)的細(xì)胞株HepG2-PCDH-CRKL及其對照組細(xì)胞株HepG2-PCDH，與HepG2-PCDH相比，HepG2-PCDH-CRKL細(xì)胞中CRKL 蛋白表達(dá)水平升高了(127.3±12.0)%(P=0.0005)(圖4B)。上調(diào)或下調(diào)CRKL后檢測了miR-429的表達(dá)變化，與HepG2-shNC相比，CRKL下調(diào)細(xì)胞株HepG2-shCRKL中miR-429表達(dá)水平升高了(102.8±20.0)%(P=0.0069)(圖4C)；與HepG2-PCDH相比，CRKL上調(diào)細(xì)胞株HepG2-PCDH-CRKL 中miR-429表達(dá)水平降低了(92.4±3.2)%(P=0.0009)(圖4D)。

3 討 論

miR-429是miR-200家族重要成員，位于人類1號染色體上，在多種腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷移、侵襲等密切相關(guān)[5-10]，但miR-429在不同類型腫瘤中發(fā)揮的作用不同，其具體作用分子機(jī)制不清。有研究報(bào)道，CRKL是miR-429的靶基因[18-19]，是CRK家族重要成員，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，可與多種信號分子結(jié)合形成復(fù)合物，將信號從上游傳遞給下游，起著承上啟下的作用，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的多功能接頭蛋白[11]。但目前只報(bào)道過miR-429抑制CRKL蛋白水平的表達(dá)，miR-429與CRKL的結(jié)合位點(diǎn)、miR-429是否影響CRKL mRNA 水平的表達(dá)以及CRKL是否調(diào)控miR-429的表達(dá)尚無人報(bào)道。

miRNA靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)miR-429與CRKL-3′-UTR存在兩處結(jié)合位點(diǎn)，miR-429是與CRKL-3′-UTR這兩處結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)結(jié)合調(diào)控CRKL的表達(dá)，還是只與一處結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。為解決這個(gè)問題，我們根據(jù)預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)了突變引物，構(gòu)建了野生型及其突變型雙熒光素重組表達(dá)載體。我們通過雙熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測，首次發(fā)現(xiàn)miR-429只與CRKL-3′-UTR第2處結(jié)合位點(diǎn)靶向結(jié)合，為研究miR-429在肝癌中的調(diào)控機(jī)制找到了作用靶點(diǎn)。

**兩組間比較，P<0.01; ***兩組間比較，P<0.001; ****兩組間比較，P<0.0001A：下調(diào)CRKL的表達(dá)；B：上調(diào)CRKL的表達(dá)；C：CRKL下調(diào)抑制內(nèi)源性miR-429表達(dá)；D：CRKL上調(diào)促進(jìn)內(nèi)源性miR-429表達(dá)圖4 CRKL對內(nèi)源性miR-429表達(dá)的影響Fig 4 Effect of CRKL on endogenous miR-429 expression

miR-429與CRKL-3′-UTR靶向結(jié)合后，是否調(diào)控CRKL的表達(dá)，為進(jìn)一步確認(rèn)CRKL是miR-429的直接調(diào)控靶基因，我們瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-429模擬物及其抑制劑，檢測miR-429過表達(dá)或低表達(dá)后對CRKL表達(dá)的影響。qRT-PCR結(jié)果表明通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，我們成功地上調(diào)或下調(diào)了miR-429的表達(dá)。WB結(jié)果表明miR-429上調(diào)可以抑制內(nèi)源性CRKL的蛋白表達(dá)，miR-429下調(diào)可以促進(jìn)內(nèi)源性CRKL的蛋白表達(dá)。miR-429對CRKL mRNA表達(dá)水平的影響無人研究，我們的結(jié)果表明：miR-429上調(diào)和下調(diào)對CRKL的mRNA表達(dá)無影響。結(jié)果說明miR-429 靶向結(jié)合于CRKL-3′-UTR在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平負(fù)性調(diào)節(jié)CRKL的表達(dá)，而對其轉(zhuǎn)錄水平無影響。

以上結(jié)果說明miR-429可通過靶向作用于CRKL-3′-UTR在轉(zhuǎn)錄后蛋白翻譯水平負(fù)性調(diào)控CRKL的表達(dá)，CRKL是否調(diào)控miR-429的表達(dá)？我們成功獲得了CRKL表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)或上調(diào)的細(xì)胞株，首次發(fā)現(xiàn)CRKL下調(diào)可促進(jìn)內(nèi)源性miR-429的表達(dá)，相反CRKL上調(diào)可抑制內(nèi)源性miR-429的表達(dá)，說明CRKL同時(shí)可以負(fù)向調(diào)控miR-429的表達(dá)，miR-429和CRKL可以互相調(diào)控，但CRKL調(diào)控miR-429的機(jī)制不清還需進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CRKL是miR-429的直接靶基因，miR-429主要直接靶向CRKL的3′端非編碼區(qū)第2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄后翻譯水抑制CRKL的表達(dá)，同時(shí)CRKL又可以調(diào)控miR-429的表達(dá)，本研究為腫瘤的小分子治療靶點(diǎn)提供了有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Fang Y, Gao W. Roles of microRNAs during prostatic tumorigenesis and tumor progression[J]. Oncogene, 2014, 33(2): 135-147.

[2] Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers [J] . Nat Rev Cancer, 2006, 6(11):857-866.

[3] Zimmerman AL, Wu S. MicroRNAs, cancer and cancer stem cells[J]. Cancer Lett, 2011, 300(1):10-19.

[4] Callegari E, Gramantieri L, Domenicali M, et al. MicroRNAs in liver cancer: a model for investigating pathogenesis and novel therapeutic approaches [J]. Cell Death Differ, 2015, 22(1):46-57.

[5] Hu X, Macdonald DM, Huettner PC, et al. A miR-200 microRNA cluster as prognostic marker in advanced ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol, 2009, 114(3):457-464.

[6] Chen J, Wang L, Matyunina LV, et al. Overexpression of miR-429 induces mesenchymal-to-epithelial transition (MET) in metastatic ovarian cancer cells[J]. Gynecol Oncol, 2011, 121(1):200-205.

[7] Sun TW, Wang CM, Xing J, et al. miR-429 modulates the expression of c-myc in human gastric carcinoma cells[J]. Eur J Cancer, 2011, 47(17):2552-2559.

[8] Snowdon J, Zhang X, Childs T, et al. The microRNA-200 family is upregulated in endometrial carcinoma[J]. PLoS One, 2011, 6(8):e22828.

[9] Li J, Du L, Yang Y, et al. MiR-429 is an independent prognostic factor in colorectal cancer and exerts its anti-apoptotic function by targeting SOX2[J]. Cancer Lett, 2013, 329(1):84-90.

[10] Wu CL, Ho JY, Chou SC, et al. MiR-429 reverses epithelial-mesenchymal transition by restoring E-cadherin expression in bladder cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7(18):26593-26603.

[11] Guo CM, Liu SQ, Sun MZ. The role of CT10 regulation of kinase-like in cancer[J]. Future Oncol, 2014, 10(16):2687-2697.

[12] Birge RB, Kalodimos C, Inagaki F, et al. Crk and CRKL adaptor proteins: networks for physiological and pathological signaling[J]. Cell Commun Signal, 2009, 7:13.

[13] Sriram G, Birge RB. Emerging roles for crk inhuman cancer[J]. Genes Cancer, 2011, 1(11):1132-1139.

[14] Bell ES, Park M. Models of Crk Adaptor Proteins in Cancer[J]. Genes Cancer, 2012, 3(5-6):341-352.

[15] Birge RB, Kalodimos C, Inagaki F, et al. Crk and CRKL adaptor proteins: networks for physiological and pathological signaling[J]. Cell Commun Signal, 2009, 7(1):1-23.

[16] Lin QY, Sun MZ, Guo CM, et al. CRKL overexpression suppresses in vitro proliferation, invasion and migration of murine hepatocarcinoma Hca-P cells[J]. Biomed Pharmacother, 2015, 69:11-17.

[17] Shi J, Meng LL, Sun MZ, et al. CRKL knockdown promotes in vitro proliferation, migration and invasion, in vivo tumor malignancy and lymph node metastasis of murine hepatocarcinoma Hca-P cells[J]. Biomed Pharmacother, 2015, 71:84-90.

[18] Wang Y, Dong X, Hu B, et al. The effects of Micro-429 on inhibition of cervical cancer cells through targeting ZEB1 and CRKL[J]. Biomed Pharmacother, 2016, 80:311-321.

[19] Wang F, Jiang C, Sun Q, et al. Downregulation of miR429 and inhibition of cell migration and invasion in nasopharyngeal carcinoma [J]. Mol Med Rep, 2016, 13(4):3236-3242.