郭春梅，劉淑清，孫明忠

(1. 大連醫(yī)科大學 生物技術系，遼寧 大連 116044；2. 大連醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室，遼寧 大連 116044)

微小RNA(miRNA)是一類長度大約為18～24個堿基的內源非編碼小RNA分子，通過與靶基因3′末端非翻譯區(qū)(3′-UTR)完全或不完全互補配對形成沉默復合體(RISC)，導致mRNA降解或抑制其翻譯，從而在轉錄后水平負性調節(jié)靶基因的表達[1-2]。miRNAs異常表達與多種疾病尤其是癌癥的發(fā)生發(fā)展相關[3-4]，是腫瘤診斷、治療及預后的研究熱點。

miR-429是miR-200家族成員之一，miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429[5]。近年來研究表明，miR-429異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移、凋亡、耐藥等密切相關，但miR-429在腫瘤中所起的作用一直有爭議，具腫瘤特異性[6-8]。一個miRNA可影響多個靶基因，而一個靶基因又受多個miRNA的調控，miR-429有多個靶基因，可通過靶向作用于ZEB1、ZEB2、Sp1、BMI1、E2F3、KIAA0101、PAK6、Onecut2、SOX2、Bcl-2、BMK1、XIAP、c-myc、SP1、PTEN、RASSF8、TIMP2、DLC-1、p27Kip1、NOTCH1調節(jié)不同的信號通路來調控腫瘤的生物行為[6-10]。

信號接頭蛋白CRKL (v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homologue(avian)-like)是CRK家族成員之一，分子量為39 kDa，編碼303個氨基酸[11-12]。CRKL包含一個SH2和兩個SH3結構域，呈現SH2-SH3-SH3結構形式，在兩個SH3結構域之間有一酪氨酸磷酸化位點(Y207)[13]。CRKL是酪氨酸激酶的關鍵底物，可通過SH2、SH3結構域招募信號通路分子，與BCAR1、GAB、ABL-1、Pax、GEF、C3G、BCR-ABL、SOS結合形成復合物參與細胞信號轉導過程，進而影響細胞的分化、增殖、粘附、遷移、侵襲、凋亡等生物活動，起著信號開關的作用[13-14]。近年來研究表明，CRKL異常表達與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、遷移、侵襲、粘附、預后、耐藥性密切相關，可能是潛在影響腫瘤治療和預后的靶標分子[13-15]。本課題組前期研究亦表明CRKL與鼠肝癌Hca-P細胞[16]的體外遷移、侵襲、增殖、克隆形成能力相關，且CRKL在小鼠肝癌高、低淋巴道轉移力細胞株Hca-P、Hca-F中差異表達[17]，提示CRKL與腫瘤密切相關。

本研究在肝癌HepG2細胞中探討了miR-429對CRKL的靶向調控作用，驗證了miR-429直接靶向結合于CRKL-3′-UTR第二個結合位點負性調節(jié)CRKL的表達，以及CRKL負性調控 miR-429的表達，揭示了miR-429和CRKL之間的負向調控關系，為臨床抗腫瘤靶向治療提供了堅實的理論基礎和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 生物信息學預測miR-429與CRKL的結合位點

應用miRNA靶基因預測在線軟件TargetScan(http://genes.mit.edu/targetscan/)、PicTar(http://pictar.bio.nqyu.edu/)和miRanda(http://microrna.sanger.ac.uk/)，根據人源CRKL的基因編碼序列，預測miR-429與CRKL的結合位點。

1.2 設計野生型CRKL-3′-UTR結合位點引物

根據預測的miR-429與CRKL-3′-UTR的結合位點，利用Oligo7軟件設計特異性引物擴增CRKL-3′-UTR包含miR-429潛在結合位點的片段，并根據psiCHECK-2雙熒光素報告載體上的多克隆酶切位點，分別在上、下游引物添加Xho I與Not I酶切位點(下劃線標記)，引物序列如下：

(1)擴增包含兩個結合位點總片段的引物

Forward primer:5'-CTCGAGGCTCATAGTGAACACAGCAGACCTAGAAATGTAGC-3'

Reverse primer:5'-GCGCGGCCGCCGGCTGATGCAAGTTTTATTGAGACAATAT-3'

(2)擴增第1個結合位點的引物

Forward primer:5'-CTCGAGGCTCATAGTGAACACAGCAGACCTAGAAATGTAGC-3'

Reverse primer:5'-TAGCGGCCGCTAAAGGGCAAACACTGTTTCTAGGCAG-3'

(3)擴增第2個結合位點的的引物

Forward primer:5'-CTCGAGGGGATGATGTGGTTTTTTGCCAGGTGTTTATAAT-3'

Reverse primer:5'-GCGGCCGCCGGCTGATGCAAGTTTTATTGAGACAATAT-3'

1.3 設計突變型CRKL-3′-UTR結合位點引物

根據定點突變PCR法對CRKL-3′-UTR兩個結合位點分別設計突變引物，引物序列如下(下劃線表示酶切位點，波浪線表示突變堿基)。

(1)突變第1個結合位點的引物

1)突變上游片段引物

Forward primer:5'-CTCGAGGCTCATAGTGAACACAGCAGACCTAGAAATGTAGC-3'

Reverse primer:5'-TTCATGAATACAGCAGTTATCTGCCTGATGGTAATCACATTTAAAG-3'

2)突變下游片段引物

Forward primer:5'-CTTTAAATGTGATTACCATCAGGCAGATAACTGCTGTATTCATG-3'

Reverse primer:5'-TAGCGGCCGCTAAAGGGCAAACACTGTTTCTAGGCAG-3'

(2)突變第2個結合位點的引物

1)突變上游片段引物

Forward primer:5'-CTCGAGGGGATGATGTGGTTTTT-3'

Reverse primer:5'-ACACTCGATGTATTCTAAGAATATAAGTCATTATTATCACTTAATTTTATAGCAC-3'

2)突變下游片段引物

Forward primer:5'-GTGCTATAAAATTAAGTGATAATAATGACTTATATTCTTAGAATACATCGAGTG-3'

Reverse primer:5'-GCGCGGCCGCCGGCTGATGCAAG-3'

1.4 構建野生型及突變型雙熒光素重組表達載體

構建野生型pMDT-19-CRKL-3'-UTR-WT、突變型pMDT-19-CRKL-3'-UTR-MUT克隆重組載體，以及野生型psiCHECK2-CRKL-3'-UTR-WT(包含miR-429與CRKL-3′-UTR兩個結合位點的序列，簡稱WT)、psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT1(包含miR-429與CRKL-3′-UTR第1個結合位點的序列，簡稱WT1)、 psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT2(包含miR-429與CRKL-3′-UTR第2個結合位點的序列，簡稱WT2)、突變型psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT1(包含miR-429與CRKL-3′-UTR第1個結合位點的突變序列，簡稱MUT1)、 psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT2(包含miR-429與CRKL-3′-UTR第2個結合位點的突變序列，簡稱MUT2)雙熒光素重組表達載體。

1.5 雙熒光素報告實驗

取對數生長期的HepG2細胞，將1×105個細胞/孔均勻鋪于24孔板，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；將實驗分WT、WT1、WT2、MUT1和MUT2組。1.5 μg psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT、psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT1、 psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-WT2、psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT1、 psiCHECK-2-CRKL-3′-UTR-MUT2重質粒分別與50 mol/L miR-429 mimics或miR-429-NC瞬時轉染到HepG2細胞中。轉染步驟按照LipofectamineTM2000說明書操作；轉染48 h后，采用promega的luciferase試劑盒進行檢測，將100 μL裂解液PLB(Passive Lysis Buffer)加到24孔板中，室溫溫育15 min后吹打細胞；將20 μL細胞裂解液轉移到黑色96孔板中，再加入50 μL LAR II(Luciferase Assay Reagent)混勻，放入酶標儀中檢測螢火蟲熒光素酶活性；向檢測管中加入100 μL Stop試劑，檢測海腎熒光素酶活性，海腎熒光素酶活性測得的數值/螢火蟲熒光素酶活性測得的數值即為每組細胞的相對熒光素活性。

1.6 qRT-PCR測定

瞬時轉染miR-429模擬物及其NC、miR-429抑制劑及其NC至HepG2細胞中，各組分別命名為HepG2-miR-429、HepG2-miR-NC、HepG2-LNA-miR-429、HepG2-LNA-miR-NC，瞬時轉染48 h后，收集各組細胞，檢測miR-429上、下調對內源性CRKL mRNA表達水平的影響。前期我們篩選到了CRKL表達穩(wěn)定下調的單克隆細胞株HepG2-shCRKL及其陰性對照組單克隆細胞株HepG2-shNC、以及CRKL表達穩(wěn)定上調的細胞株HepG2-PCDH-CRKL及其對照組細胞株HepG2-PCDH，細胞培養(yǎng)至對數生長期，收集各組細胞，檢測CRKL表達上、下調對miR-429表達水平的影響。Trizol試劑提取細胞總RNA。利用Applied Biosystems StepOneTMReal-Time PCR Systems系統(tǒng)進行qRT-PCR反應，采用2-ΔΔCt法ACTB作為內參計算CRKL mRNA的相對表達水平，U6作為內參計算miR-429的相對表達水平。ACTB：F primer 5′-AGGCCAACCGCGAGAAG-3′, R primer 5′-ACAGCCTGGATAGCAACGTACA-3′; CRKL: F primer 5′-GTGCTTATGACAAGACTGCCT-3′, R primer 5′-CACTCGTTTTCATCTGGGTTT-3′。

1.7 Western blot (WB) 測定

瞬時轉染miR-429模擬物及其NC、miR-429抑制劑及其NC至HepG2細胞中72 h后，分別收集HepG2-miR-429、HepG2-miR-NC、HepG2-LNA-miR-429、HepG2-LNA-miR-NC各組細胞，檢測miR-429上、下調對內源性CRKL蛋白表達水平的影響。RIPA buffer (50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS in the presences of 1 mmol/L Na3VO4, 1 μg/mL leupeptin and 0.5 mmol/L PMSF)提取細胞總蛋白，10%SDS-PAGE電泳后蛋白轉移至NC膜，一抗、二抗孵育后，ECL發(fā)光液顯影，利用凝膠成像系統(tǒng)軟件Image Lab software 4.0.1分析CRKL/ACTB相對灰度值。

1.8 統(tǒng)計學方法

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，實驗數據以均值±標準差(x±s)表示，各組間比較采用t檢驗分析，P≤ 0.05表示具有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 預測miRNA的靶基因

通過在線軟件預測miR-429調控的靶基因，發(fā)現TargetScan、PicTar和miRanda軟件均預測出CRKL，CRKL可能是miR-429的潛在靶基因。miR-429與CRKL-3′-UTR存在兩處結合位點，如圖1所示。為證實CRKL是miR-429的直接靶基因，首先擴增了CRKL-3′-UTR區(qū)包含miR-429結合位點的序列，構建了野生型的雙熒光素酶報告載體，為證明確實是miR-429作用預測的結合位點導致熒光素酶活性發(fā)生改變，又突變了CRKL-3′-UTR區(qū)包含miR-429結合位點的序列并構建了突變型雙熒光素重組表達載體。

圖1 miR-429與CRKL-3′-UTR結合位點Fig 1 Putative binding sites for miR-429 at CRKL-3′-UTR

2.2 雙熒光素報告實驗驗證miR-429與CRKL-3′-UTR靶向結合

構建好野生型psiCHECK2-CRKL-3'-UTR-WT及突變型psiCHECK2-CRKL-3'-UTR-MUT重組表達載體后，通過雙熒光素酶報告實驗檢測發(fā)現(圖2)：與miR-NC相比，miR-429與psiCHECK-2-CRKL-3-UTR-WT共轉染后使熒光素酶活性下降了(45.7±1.1)%(P=0.004)；miR-429與WT2共轉染后使熒光素酶活性下降了(37.0±0.8)%(P=0.0008)，當這個結合位點被突變后，miR-429對熒光素酶活性的抑制作用基本被消除；而miR-429與WT1、MUT1共轉染后對熒光素酶活性沒影響。說明CRKL是miR-429的靶基因，miR-429主要靶向CRKL-3′-UTR第2個結合位點抑制CRKL的表達。

**兩組間比較，P<0.01; ***兩組間比較，P<0.001圖2 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-429與CRKL-3′-UTR區(qū)結合Fig 2 Interaction between miR-429 and CRKL-3′-UTR detected with luciferase activity assay

2.3 miR-429負性調控CRKL的表達

瞬時轉染miR-429模擬物及其NC、miR-429抑制劑及其NC至HepG2細胞中48 h后， HepG2-miR-429中的miR-429表達比HepG2-miR-NC上調了(6373600±10220)%(P=0.0034)(圖3A)；HepG2-LNA-miR-429中的miR-429表達比HepG2-LNA-miR-NC下調了(76.2±3.7)%(P=0.0103)(圖3B)。而HepG2-miR-429中的內源性CRKL 蛋白表達比HepG2-miR-NC下調了(55.0±1.5)%(P=0.0089)(圖3C)，HepG2-LNA-miR-429中的內源性CRKL 蛋白表達比HepG2-LNA-miR-NC上調了(44.3±1.0)%(P=0.0038)(圖3D)。但HepG2-miR-429及HepG2-LNA-miR-429與各自nc組比較其內源性CRKL mRNA 表達變化不大(圖3C、D)。

*兩組間比較，P<0.05; **兩組間比較，P<0.01A：瞬時轉染miR-429模擬物上調miR-429的表達；B：瞬時轉染miR-429抑制劑下調miR-429的表達；C：miR-429上調抑制內源性CRKL蛋白表達；D：miR-429下調促進內源性CRKL蛋白表達圖3 miR-429對內源性CRKL表達的影響Fig 3 Effect of miR-429 on endogenous CRKL expression

2.4 CRKL負性調控miR-429的表達

G418有限稀釋法篩選得到了CRKL表達穩(wěn)定下調的單克隆細胞株HepG2-shCRKL及其陰性對照組單克隆細胞株HepG2-shNC，與HepG2-shNC相比，HepG2-shCRKL細胞中CRKL 蛋白表達水平降低了(97.0±0.6)%(P<0.0001)(圖4A)。通過慢病毒轉染篩選得到了CRKL表達穩(wěn)定上調的細胞株HepG2-PCDH-CRKL及其對照組細胞株HepG2-PCDH，與HepG2-PCDH相比，HepG2-PCDH-CRKL細胞中CRKL 蛋白表達水平升高了(127.3±12.0)%(P=0.0005)(圖4B)。上調或下調CRKL后檢測了miR-429的表達變化，與HepG2-shNC相比，CRKL下調細胞株HepG2-shCRKL中miR-429表達水平升高了(102.8±20.0)%(P=0.0069)(圖4C)；與HepG2-PCDH相比，CRKL上調細胞株HepG2-PCDH-CRKL 中miR-429表達水平降低了(92.4±3.2)%(P=0.0009)(圖4D)。

3 討 論

miR-429是miR-200家族重要成員，位于人類1號染色體上，在多種腫瘤中異常表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷移、侵襲等密切相關[5-10]，但miR-429在不同類型腫瘤中發(fā)揮的作用不同，其具體作用分子機制不清。有研究報道，CRKL是miR-429的靶基因[18-19]，是CRK家族重要成員，廣泛存在于真核生物體內，可與多種信號分子結合形成復合物，將信號從上游傳遞給下游，起著承上啟下的作用，是信號轉導中重要的多功能接頭蛋白[11]。但目前只報道過miR-429抑制CRKL蛋白水平的表達，miR-429與CRKL的結合位點、miR-429是否影響CRKL mRNA 水平的表達以及CRKL是否調控miR-429的表達尚無人報道。

miRNA靶基因預測軟件發(fā)現miR-429與CRKL-3′-UTR存在兩處結合位點，miR-429是與CRKL-3′-UTR這兩處結合位點同時結合調控CRKL的表達，還是只與一處結合位點結合。為解決這個問題，我們根據預測的結合位點序列，設計了突變引物，構建了野生型及其突變型雙熒光素重組表達載體。我們通過雙熒光素報告實驗檢測，首次發(fā)現miR-429只與CRKL-3′-UTR第2處結合位點靶向結合，為研究miR-429在肝癌中的調控機制找到了作用靶點。

**兩組間比較，P<0.01; ***兩組間比較，P<0.001; ****兩組間比較，P<0.0001A：下調CRKL的表達；B：上調CRKL的表達；C：CRKL下調抑制內源性miR-429表達；D：CRKL上調促進內源性miR-429表達圖4 CRKL對內源性miR-429表達的影響Fig 4 Effect of CRKL on endogenous miR-429 expression

miR-429與CRKL-3′-UTR靶向結合后，是否調控CRKL的表達，為進一步確認CRKL是miR-429的直接調控靶基因，我們瞬時轉染miR-429模擬物及其抑制劑，檢測miR-429過表達或低表達后對CRKL表達的影響。qRT-PCR結果表明通過瞬時轉染，我們成功地上調或下調了miR-429的表達。WB結果表明miR-429上調可以抑制內源性CRKL的蛋白表達，miR-429下調可以促進內源性CRKL的蛋白表達。miR-429對CRKL mRNA表達水平的影響無人研究，我們的結果表明：miR-429上調和下調對CRKL的mRNA表達無影響。結果說明miR-429 靶向結合于CRKL-3′-UTR在轉錄后翻譯水平負性調節(jié)CRKL的表達，而對其轉錄水平無影響。

以上結果說明miR-429可通過靶向作用于CRKL-3′-UTR在轉錄后蛋白翻譯水平負性調控CRKL的表達，CRKL是否調控miR-429的表達？我們成功獲得了CRKL表達穩(wěn)定下調或上調的細胞株，首次發(fā)現CRKL下調可促進內源性miR-429的表達，相反CRKL上調可抑制內源性miR-429的表達，說明CRKL同時可以負向調控miR-429的表達，miR-429和CRKL可以互相調控，但CRKL調控miR-429的機制不清還需進一步探討。

本實驗結果表明，CRKL是miR-429的直接靶基因，miR-429主要直接靶向CRKL的3′端非編碼區(qū)第2個結合位點在轉錄后翻譯水抑制CRKL的表達，同時CRKL又可以調控miR-429的表達，本研究為腫瘤的小分子治療靶點提供了有利的實驗依據。

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