張楊, 吳仁人, 張一敏, 賈樂華

1. 武漢理工大學資源與環(huán)境工程學院, 武漢 430070

2. 環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所, 廣州 510655

3. 武漢科技大學資源與環(huán)境工程學院, 武漢 430081

4. 華南理工大學生物科學與工程學院, 廣州 510006

5. 廣東省水與大氣污染防治重點實驗室, 廣州 510655

1 前言

隨著我國人口的快速增長及人民生活水平的提高, 人們對畜禽產(chǎn)品的需求量與日俱增, 使得畜禽養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大。滿足了人民生活需求的同時,也給環(huán)境、生態(tài)及人類健康帶來了極大的危害。大量畜禽糞便或糞便沖洗廢水未經(jīng)處理排入水體中,其中的氮、磷及有機質(zhì)等會造成水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致水質(zhì)惡化[1], 且畜禽污水還會以多種作用方式破壞水生生態(tài), 導(dǎo)致水生生物死亡, 嚴重威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展[2]。據(jù)調(diào)查[3], 20世紀90年代, 上海絕大部分畜牧場周圍河水逐漸變?yōu)楹诔羲w, 魚類瀕臨滅菌。同時, 畜禽糞便未經(jīng)處理排入地表水中可能會引起水源性疾病的爆發(fā)。據(jù)WHO統(tǒng)計, 全球每年有1800萬人死于包括霍亂在內(nèi)的感染性腹瀉病, 90%是 5歲以下的兒童, 絕大多數(shù)發(fā)生在衛(wèi)生資源較為欠缺的發(fā)展中國家; 13300萬人面臨腸道寄生蟲感染,從而導(dǎo)致嚴重腹瀉和貧血等后果, 造成每年大約9400人死亡[4]。

由于水體受糞便污染問題日益加劇, 為了能夠進行及時有效地控制和治理, 以糞源污染指示菌評價水體質(zhì)量得到了廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)的糞便指示菌通常為糞大腸菌及大腸埃希氏菌等, 但因其在生物腸道內(nèi)并非優(yōu)勢菌群、在適宜的外界環(huán)境中可能繁殖、與致病菌聯(lián)系少等缺陷, 使得擬桿菌、Faecalibaterium等專性厭氧菌在微生物污染源解析中越來越受到青睞。已有研究表明, 擬桿菌、Faecalibaterium及梭狀芽胞桿菌等為人、豬、狗、牛、家禽腸道中的優(yōu)勢菌群[5-9], 且在自然環(huán)境中不能生存繁殖, 因此可以作為糞便微生物源解析指示菌, 避免環(huán)境中存在的微生物以及細菌自我繁殖等因素對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。同時, 以動物腸道中的優(yōu)勢菌群作為糞便污染指示菌, 較傳統(tǒng)指示菌具有更高的靈敏度, 可以為生態(tài)環(huán)境的規(guī)劃、治理提供及時有效的信息。

近年來, 歐美等發(fā)達國家已針對動物腸道中的優(yōu)勢菌群, 開發(fā)出了包括豬[8]、牛[9-10]、雞[7]等常見畜禽養(yǎng)殖動物的宿主特異性源解析引物,并成功用于識別水體糞便污染源。然而, 寄居于動物腸道內(nèi)的不同微生物之間相互作用極為復(fù)雜,且不同地區(qū)的氣候環(huán)境、飼養(yǎng)條件都會導(dǎo)致動物腸道內(nèi)的微生物豐度、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化, 從而造成引物的適用性存在地區(qū)差異。例如, 在加拿大安大略省對野鵝糞便進行生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)梭狀芽胞桿菌占腸道菌的 38.4%, 而在美國俄亥俄州則占28.9%[11]。在日本江別市等地區(qū)進行檢測時, Okabe等[12]設(shè)計的豬源擬桿菌特異性引物Bac41F/PS183R 表現(xiàn)出很好的特異性, 而Mieszkin在法國布列塔尼地區(qū)進行驗證時發(fā)現(xiàn)該引物也能與其它動物產(chǎn)生交叉反應(yīng)。同時, 由于禽類生活、飲食習慣及飛行本能等原因, 導(dǎo)致其在進化中腸道構(gòu)造及功能與哺乳動物相比具有明顯不同, 禽類與哺乳動物腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)等也具有較明顯的差異[7,13]。王海鷹等[14]已在珠江三角洲地區(qū)針對哺乳動物開發(fā)的引物進行了驗證,并成功挑選出適用于該地區(qū)的人、反芻動物及豬的擬桿菌特異性引物, 而關(guān)于針對珠三角地區(qū)雞源腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群設(shè)計出的特異性引物驗證尚未見報導(dǎo), 因此本研究提取珠江三角洲地區(qū)多種畜禽糞便樣品的 DNA, 選取針對雞源腸道內(nèi)不同菌群而開發(fā)的宿主特異性引物進行地區(qū)適用性驗證, 為珠江三角洲地區(qū)水環(huán)境糞便污染來源分析提供一定的理論支持。

2 材料和方法

2.1 樣本采集

在珠江三角洲地區(qū)東江和北江等流域的多個畜禽養(yǎng)殖場及廣州市某醫(yī)院采集家禽、家畜等動物及人的糞便樣品。糞便樣品數(shù)共計72份, 其中： 廣東省清遠市21份、廣東省惠州市惠城區(qū)23份、廣東省惠州市博羅縣23份、廣州市5份; 雞25份、豬18份、牛6份、鴨6份、羊5份、鵝5份、鴿子1份、狗1份、人5份。所有樣品編號, 保存于冰盒中, 6h內(nèi)帶回實驗室進行樣品處理。

2.2 DNA提取

采用天根公司糞便基因組 DNA提取試劑盒通過破碎、吸附柱純化等方法提取糞便樣品中的DNA。通過 NanoVue超微量紫外/可見光光度計測定所提取DNA濃度及A260/A280值, 并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 PCR擴增

實驗所需引物見表1。PCR 反應(yīng)體系15 μL： 2×PCR DSMix 7.2 μL, 10 μmol·L-1上下游引物各 0.6 μL, DNA模板(10 ng·μL-1)0.6 μL, 超純水 6 μL。PCR 擴增條件： 94℃·L-1變性 3 min, 94 ℃變性 30 s, 55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸90 s, 重復(fù)30個循環(huán), 72 ℃延伸10 min。

2.4 數(shù)據(jù)分析

靈敏度(r)和特異性(s)采用以下公式進行分析：r=[TP/(TP＋FN)] ,s=[TN/(TN＋FP)][18]。其中：TP表示引物擴增自己種屬樣品時的陽性樣本數(shù),FN表示擴增自己種屬樣本時的陰性樣本數(shù);TN表示引物擴增其他種屬樣品時的陰性樣本數(shù),FP表示擴增其他種屬樣品時的陽性樣本數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 基因組DNA提取

采用試劑盒提取的糞便基因組DNA濃度、樣品數(shù)以及A260/A280的比值如表2所示。糞便基因組提取的純度是后續(xù)實驗的基礎(chǔ), 而A260/A280比值通常用于指示樣品DNA的純度。純DNA的A260/A280比值為1.8。當A260/A280＜1.6, 表明可能存在蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染; A260/A280＞1.9, 可能存在RNA污染[19]。對于 PCR實驗而言, DNA的A260/A280理想比值應(yīng)在1.8—2.0范圍內(nèi)[20]。由表2可知, 采用糞便基因組提取試劑盒提取的DNA純度均符合后續(xù)實驗要求, 并且具有提取效率高, 穩(wěn)定性好等優(yōu)勢。

3.2 特異性引物的驗證

表1 雞的不同菌屬特異性生物標記引物Tab. 1 Chicken-specific primers of different strains

以不同動物糞便中提取的DNA為模板, 選取已有的雞源特異性引物, 分別進行PCR擴增。每種引物擴增后所得到的陽性結(jié)果統(tǒng)計及各引物的靈敏度、特異性分析結(jié)果見表3和表4。

采用Faecalibaterium通用引物(1#)對各糞便樣品DNA進行擴增, 結(jié)果顯示在72份樣品中, 得到了63個陽性結(jié)果, 具有較高的檢出率?？傮w而言, Faecalibaterium為雞、鴨等禽類動物糞便中的優(yōu)勢菌群。如 Duan等[21]在分析禽類動物糞便中的微生物多樣性時發(fā)現(xiàn), Faecalibaterium在禽類腸道中的比例大于40%, 遠高于擬桿菌等其它腸道微生物, 而擬桿菌則在哺乳動物腸道內(nèi)含量較高[22]。禽類動物腸道的構(gòu)造、長度及消化方式?jīng)Q定了它們與哺乳動物腸道內(nèi)的微生物組成、相對豐度具有較大差異。因此, 理論上Faecalibaterium在禽類糞便中的擴增效果要優(yōu)于哺乳動物。而在本研究中, 1#引物不僅對禽類糞便有較高的檢出率, 對豬、牛、羊等家畜也全部檢出。這說明在目標研究區(qū)域, 1#引物普遍適用于大部分畜禽動物糞便的源解析研究, 而不是僅針對禽類糞便污染源, 在初期評價水體質(zhì)量時可以避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果而導(dǎo)致低估水體受糞便污染程度。同時,應(yīng)用宿主特異性引物進行源解析時, 也可以通過分析各引物與通用引物 1#之間的相關(guān)性來確定糞便污染的主要貢獻源。

表2 糞便樣品基因組DNA濃度, A260/A280值及樣品數(shù)Tab. 2 Concentration, absorbance ratio of 260/280nm and sample number of genome DNA of fecal samples

表3 雞源特異性引物PCR擴增結(jié)果Tab. 3 Positive results obtained with chicken-specific primers

隨著微生物污染源解析技術(shù)的發(fā)展, 引物的地區(qū)適用性研究成為了該領(lǐng)域的重要環(huán)節(jié)之一, 而靈敏度與特異性是評價引物適用性的重要指標, 但目前仍沒有針對引物評價的統(tǒng)一標準。在進行微生物污染源解析時, 不同引物在不同的區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出的靈敏度、特異性及衰減特征都可能發(fā)生變化。Ahmed等[23]在分析多種人源擬桿菌特異性引物在不同地區(qū)適用性的研究中指出, 當引物的靈敏度和特異性均大于80%, 該引物表現(xiàn)較好。若引物的靈敏度小于 80%, 而特異性大于 90%, 該引物同樣可以接受。本研究參照此范圍對已開發(fā)的各類雞源特異性引物進行地區(qū)適用性驗證。采用雞的 Faecalibaterium 特異性引物(2#和 3#)對不同動物糞便樣品進行 PCR擴增時, 2#引物表現(xiàn)出了較好的特異性(100%), 但靈敏度較差, 僅為12%。而3#引物甚至未能擴增出陽性結(jié)果, 因此未能對其特異性進行評估。采用雞的短桿菌引物(4#)對糞便樣品進行驗證時, 共產(chǎn)生 8個陽性結(jié)果。其中, 針對雞糞的陽性結(jié)果有7個, 鴨糞 1個, 特異性達到 97%, 但靈敏度僅為 28%。驗證雞的擬桿菌特異性引物(5#、6#和 7#)時發(fā)現(xiàn), 5#和 7#引物的特異性較好(分別為87%和95%), 但靈敏度較差, 僅為20%和36%。6#引物靈敏度為76%, 但其在47份產(chǎn)生了32個陽性擴增結(jié)果, 使其特異性較差(68%)。雞的梭狀芽胞桿菌引物(8#)在25份雞糞樣品中產(chǎn)生了21個陽性擴增結(jié)果, 靈敏度為84%。該引物在鴨、鵝及鴿等飛禽樣品中也產(chǎn)生了陽性擴增, 同時與哺乳動物產(chǎn)生了少量的交叉反應(yīng), 其特異性僅為55%。

表4 雞源特異性引物靈敏度與特異性分析Tab. 4 Sensitivity and specificity of the chicken-primers analyzed

Kobayashi等[13]在日本部分地區(qū)驗證6#引物時發(fā)現(xiàn), 該引物針對雞腸道中的擬桿菌不僅具有較高的特異性, 同時還可以排除鴨糞樣品的干擾, 這與本研究有較大差異。而Lu等[7]驗證雞的特異性梭狀芽胞桿菌引物時發(fā)現(xiàn), 8#引物會在禽類糞便之間出現(xiàn)交叉反應(yīng)。從表 3可以看出, 雞的特異性擬桿菌引物(6#)和梭狀芽胞桿菌引物(8#)特異性較差的主要原因是在鴨和鵝的糞便樣品中也產(chǎn)生了陽性擴增。這可能是由于在同一地區(qū)雞、鴨、鵝等常見家禽的生活習慣、腸道結(jié)構(gòu)及消化方式等具有一定程度的相似性, 基于這一特性將源解析的目標物種由雞擴大至禽類, 部分特異性基因標記可以表現(xiàn)出較好的靈敏度及特異性(圖1)。

圖1 6#和8#引物在雞和禽類中的靈敏度和特異性Fig. 1 Sensitivity and specificity of 6# and 8# primers in chicken and poultry

由圖1可以看出, 6#引物對禽類糞便檢測的靈敏度及特異性分別為 86%和 81%, 與針對雞糞的檢測結(jié)果相比較, 靈敏度下降了 6%, 但特異性提高了13%; 8#引物針對禽類動物糞便中基因組進行特異性擴增時, 靈敏度和特異性分別為 89%和 72%, 較雞糞的擴增結(jié)果其靈敏度提高了 5%, 特異性提高了17%, 盡管其特異性與本文參照標準相差 8%, 但由于靈敏度已接近于 90%, 因此也可適用于目標研究區(qū)域。這一結(jié)果也說明了6#和8#引物雖然針對雞糞樣品效果較差, 但可適用于珠三角地區(qū)禽類糞便污染的源解析研究。近年來, 諸多關(guān)于動物糞便的源解析工作及流行病學研究也都將禽類歸為一類作為研究對象。例如, Li等[24]在研究不同動物糞便中的致病菌時, 將家禽及野生飛鳥糞便歸為一類, 將采集到的糞便混合后再進行分析。因此, 將雞、鴨、鵝等家禽歸為一類研究目標而不考慮不同禽類間的相互影響也是滿足微生物污染源解析要求的。

與大腸桿菌相比而言, Faecalibaterium、短桿菌、擬桿菌及梭狀芽胞桿菌在各類動物腸道中的數(shù)量遠大于大腸桿菌。同時, 這些腸道中的優(yōu)勢菌群具有更好的宿主特異性。但不同動物腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群的數(shù)量及種類差異較大, 在解析糞便污染來源時應(yīng)針對不同的物種而選用不同的指示菌。例如, Duan等[21]發(fā)現(xiàn)擬桿菌在人的腸道微生物中所占比例為 43%,在雞和鴨中只有 12%。與此相對, 多種研究表明Faecalibaterium、短桿菌及梭狀芽胞桿菌在禽類腸道中的比例占 40%—70%, 因此針對雞糞污染進行源解析時應(yīng)選取Faecalibaterium等指示菌[16,21,25-26]。

然而, 宿主腸道內(nèi)的微生物容易受到不同外界環(huán)境的干擾而導(dǎo)致指示菌的基因發(fā)生變化, 從而造成宿主特異性引物存在較明顯的地區(qū)適用性問題。例如, 本研究在珠三角地區(qū)驗證的2#、3#、4#引物均存在靈敏度較差的問題, 而段傳人等[15]在重慶地區(qū)驗證 2#和 3#的靈敏度分別為 40%和 70%, 同時Weidhaas等[16]在美國俄克拉荷馬州和佐治亞州部分地區(qū)識別出4#引物在目標研究區(qū)域同時具有較高的靈敏度和較強的特異性。因此, 即使確定了在目標研究區(qū)域所采用的指示菌, 也須通過大量的驗證實驗篩選針對指示菌開發(fā)的特異性引物, 避免在后續(xù)的源解析研究中產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。

4 結(jié)論

1 Faecalibaterium通用引物1#(FAU)有較高的檢出率, 適用于評估珠江三角洲地區(qū)糞便污染程度。

2 糞便污染源解析目標若由雞類擴大至禽類,則6#引物的特異性提高至81%, 8#引物的靈敏度及特異性分別提高至 89%和 72%, 兩種引物均適用于珠三角地區(qū)禽類糞便污染源解析。

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