劉志平，岳夢(mèng)琳

(平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 河南 平頂山 467000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。侵襲是腫瘤的十大特征之一，也是導(dǎo)致乳腺癌患者不良預(yù)后甚至死亡的重要原因之一[2]。金屬蛋白酶組織抑制物2(tissue inhibitors of metalloproteinase 2，TIMP-2)通路在腫瘤的侵襲中具有極其重要的作用[3]，TIMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP9)的抑制物，而MMP2和MMP9能夠降解幾乎所有類型的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，促進(jìn)腫瘤的侵襲[4]。大量研究已經(jīng)證實(shí)，通過降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)MMP2和MMP9的表達(dá)，可以抑制腫瘤細(xì)胞侵襲能力[5]。在多種腫瘤包括乳腺癌中，TIMP-2呈低表達(dá)[6]，而具體機(jī)制尚不明確。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類長度約22～24 nt的非編碼小分子RNA，在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用，近年來的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-106a(microRNA-106a)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。因此，本研究將探討microRNA-106a是否通過調(diào)節(jié)TIMP-2通路，促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲，旨在為乳腺癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購自Gibco；脂質(zhì)體Lipofectamine?3000、TRIzol試劑和RNA提取試劑盒均購自Invitrogen；microRNA序列和qPCR引物序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo;兔抗人TIMP-2多克隆抗體和兔抗人GAPDH單克隆抗體均購自Santa Cruz；兔抗人MMP2多克隆抗體和兔抗人MMP9多克隆抗體均購自CST；HRP標(biāo)記的羊抗兔 II 抗購自上海英基生物科技有限公司；ECL發(fā)光液購自Millipore；Matrigel購自上海前塵生物科技有限公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱(BB15，Thermo)；超微量核酸蛋白測(cè)定儀(ND2000，Thermo)；定量PCR擴(kuò)增儀(ABI 7500，ABI)；凝膠成像儀(GelDoc-It，UVP)；顯微鏡(BX61，Olympus)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10% 胎牛血清，1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，37 ℃、5% CO2條件下中培養(yǎng)，取復(fù)蘇后第4～10代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

取4×105個(gè)處于對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，接種于6 cm培養(yǎng)皿中，24 h后采用脂質(zhì)體Lipofectamine?3000將microRNA-106a抑制物(microRNA-106a inhibitor)、microRNA-106a 模擬物(microRNA-106a mimic)及microRNA無關(guān)序列(即陰性對(duì)照組,negative control組)轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中，操作步驟參照試劑說明書。取未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對(duì)照組(control組)。

2.2qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率 收集1×105細(xì)胞，各細(xì)胞樣品中加入1 mL TRIzol試劑，抽提細(xì)胞總RNA，按照RNA提取試劑盒的說明書操作。超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)總RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。MMP2、MMP9、TIMP-2、GAPDH、microRNA-106a及內(nèi)參照U6的引物序列見表1。定量PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)microRNA-106a表達(dá)水平。qPCR擴(kuò)增體系為10 μL，反應(yīng)條件為: 50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示microRNA-106a相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for qPCR

2.3Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 收集(2～5)×105個(gè)細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，抽提細(xì)胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉1 h，TBS-T洗膜，加入兔抗人TIMP2多克隆抗體(1∶2 000稀釋)、兔抗人MMP2多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人MMP-9多克隆抗體(1∶1 000稀釋)和兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔 II 抗(1∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像儀對(duì)蛋白條帶進(jìn)行觀察，獲取圖像，并對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析(Image Lab軟件)，記錄灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參照蛋白的灰度比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 Transwell小室置于24孔板中，在小室的聚碳酸酯膜上加入4.0 g/L Matrigel 50 μL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜，使Matrigel凝固；在24孔板下室中加入500 μL的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，Transwell小室中加入150 μL的細(xì)胞懸液(細(xì)胞總數(shù)約1×105個(gè))；48 h后去除24孔板下室中的培養(yǎng)液，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)室膜上的細(xì)胞，將Transwell小室置于0.1%結(jié)晶紫溶液中，室溫染色5 min，去離子水中洗滌后，顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照(×400)，并記錄每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(luciferase reporter assay)檢測(cè)基因表達(dá)情況 PCR擴(kuò)增克隆人TIMP-2基因3’非翻譯區(qū)(3’ untranslated region，3’-UTR)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶SmaI和KpnI酶切后，插入pGL3-Basic螢光素酶報(bào)告基因載體，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定，構(gòu)建含有TIMP-2基因3’-UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT，同時(shí)構(gòu)建含有突變TIMP-2基因3’-UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut。

MDA-MB-231細(xì)胞接種于24孔板中，融合度在70%～80%時(shí)，脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染microRNA-106a inhibitor(或microRNA-106a mimic)，報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT(或pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut或pGL3-Basic空載體)以及pRL-SV40海腎螢光素酶表達(dá)載體內(nèi)參照質(zhì)粒；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染48 h后，采用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟如下：棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，每孔加入100 μL PLB裂解液，-80 ℃冰箱裂解1 h，收集細(xì)胞裂解液，離心，取上清。EP管中加入10 μL上清，再加入50 μL LAR II，檢測(cè)螢火蟲螢光素酶活性；隨后加入50 μL Stop & Glo試劑，檢測(cè)內(nèi)參照海腎螢光素酶的活性，兩者的比值即為pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT、pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut和pGL3-Basic空載體的相對(duì)螢光素酶活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩處理效應(yīng)組間比較采用t檢驗(yàn)，多處理效應(yīng)組間比較采用單因素方差分析，并用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MicroRNA-106a inhibitor及microRNA-106a mimic的轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染microRNA-106a inhibitor 48 h后，細(xì)胞內(nèi)的microRNA-106a表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染microRNA-106a mimic 48 h后，細(xì)胞內(nèi)的microRNA-106a表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The expression levels of microRNA-106a in breast cancer MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)microRNA-106a表達(dá)水平

2 MicroRNA-106a對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用

為研究microRNA-106a對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲影響，在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了microRNA-106a inhibitor/mimic，隨后采用Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的變化情況。經(jīng)單因素方差分析顯示，4組整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.286，P=0.001)。MicroRNA-106a inhibitor組的侵襲細(xì)胞數(shù)目低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，microRNA-106a mimic組的侵襲細(xì)胞數(shù)目高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 2. The effect of microRNA-106a on the invasion ability of breast cancer MDA-MB-231cells (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05 control group.

圖2MicroRNA-106a對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231侵襲能力的影響

3 MicroRNA-106a對(duì)TIMP-2通路的影響

qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3組中TIMP-2、MMP2及MMP9的mRNA相對(duì)表達(dá)量整體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染microRNA-106a mimic 48 h后，細(xì)胞內(nèi)MMP2和MMP9的mRNA相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05)，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；細(xì)胞內(nèi)TIMP-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05)，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3A。

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3B。單因素方差分析顯示，3組TIMP-2、MMP2及MMP9 的蛋白相對(duì)表達(dá)量整體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染microRNA-106a mimic 48 h后，細(xì)胞內(nèi)MMP2和MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05)，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；細(xì)胞內(nèi)TIMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05)，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

4 螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)microRNA-106a對(duì) TIMP-2通路的調(diào)控作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)單因素方差分析顯示，整體差異顯著(F=265.931，P=0.000)。MicroRNA-106a inhibitor+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT組的相對(duì)螢光素酶活性高于microRNA-106a inhibitor+pGL3-Basic空載體對(duì)照組和microRNA-106a inhibitor+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut組(P<0.05)；microRNA-106a mimic+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT組的相對(duì)螢光素酶活性低于microRNA-106a mimic+pGL3-Basic空載體對(duì)照組和microRNA-106a mimic+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut組(P<0.05)。

討 論

乳腺癌是女性健康的第一殺手，隨著不斷更新的綜合治療方案的出現(xiàn)，乳腺癌患者的治療效率得到了很大的提高，然而，侵襲與復(fù)發(fā)是導(dǎo)致乳腺癌患者不良預(yù)后甚至死亡的重要原因之一。探尋導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生侵襲的內(nèi)在機(jī)制，尋找能夠預(yù)測(cè)甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤侵襲的靶標(biāo)，是臨床上亟待解決的問題[8]。

近年來，microRNA調(diào)控基因表達(dá)的功能受到廣泛的關(guān)注，有研究表明，microRNA能夠調(diào)控大約60%的蛋白編碼基因[9]。microRNA是由Drosha酶和Dicer酶剪切microRNA前體而來，它能夠通過與靶基因mRNA的3’-UTR區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平或者轉(zhuǎn)錄后水平，降低靶基因的表達(dá)水平，導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。Calin等[11]在2002年首次提出了microRNA與腫瘤相關(guān)，證實(shí)microRNA-15a和microRNA-16-1缺失能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。目前，愈來愈多的研究證實(shí)，microRNA在腫瘤中發(fā)揮著類似抑癌基因或癌基因的作用[12-13]。在各種腫瘤組織中，microRNA-106a的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞包括乳腺癌細(xì)胞的凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，Xiao等[14]在胃癌中的研究表明，microRNA-106a的高表達(dá)與腫瘤的分期、分化、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；Chen等[15]研究證實(shí)，microRNA-106a能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲；而Shin等[7]的研究則表明，在膀胱癌細(xì)胞中，microRNA-106a能夠通過調(diào)節(jié)MAPK通路，抑制細(xì)胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移。本研究則分析microRNA-106a在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲過程中的作用，并對(duì)其內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行初步探討。

Figure 3. The effects of microRNA-106a on the expression of TIMP-2, MMP2 and MMP9 at mRNA (A) and protein (B) levels in breast cancer MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsnegative control group.

圖3MicroRNA-106a對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中TIMP-2、MMP2以及MMP9的mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Figure 4. The regulatory role of microRNA-106a in the TIMP-2 pathway investigated by luciferase reporter assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspGL3-Basic empty vector group;#P<0.05vspGL3-Basic-TIMP-2-3’UTR WT group.

圖4螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)microRNA-106a對(duì)TIMP-2通路的調(diào)控作用

我們首先在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染了microRNA-106a inhibitor 和microRNA-106a mimic，48 h后細(xì)胞內(nèi)的microRNA-106a水平分別顯著地降低和升高。采用Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)探究microRNA-106a與乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)microRNA-106a能夠顯著增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。ECM是腫瘤侵襲過程中必須突破的障礙，MMP2和MMP9能夠降解ECM，促進(jìn)腫瘤的侵襲，而TIMP-2是MMP2和MMP9的天然抑制劑，TIMP-2增加，將抑制腫瘤的侵襲[16]。在探討microRNA-106a促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的機(jī)制研究中，本研究重點(diǎn)關(guān)注了TIMP-2信號(hào)通路。上調(diào)microRNA-106a表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)的TIMP-2的 mRNA與蛋白表達(dá)水平顯著降低，而其抑制底物MMP2和MMP9的mRNA與蛋白表達(dá)水平顯著增加。采用螢光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)來研究microRNA-106a是否能夠直接調(diào)控TIMP-2的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在microRNA-106a inhibitor 和microRNA-106a mimic對(duì)報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT的活性有顯著影響，即microRNA-106a inhibitor能夠增強(qiáng)pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT的活性，而microRNA-106a mi-mic則降低了pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT的活性，證實(shí)microRNA-106a能夠直接調(diào)控TIMP-2的表達(dá)。本研究證實(shí)，在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，microRNA-106a表達(dá)增加后，細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)，并且高表達(dá)的microRNA-106a能夠降低MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)TIMP-2的表達(dá)，增加MMP2和MMP9的表達(dá)；螢光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)證實(shí)，microRNA-106a 能夠直接負(fù)調(diào)控TIMP-2的表達(dá)。已有研究證實(shí)，microRNA-106a通過調(diào)控TIMP-2基因表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞[17]、胰腺癌[18]和胃癌[19]等腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移。本研究并未對(duì)其它與細(xì)胞侵襲相關(guān)的信號(hào)通路和基因進(jìn)行探討，在后期研究中，將對(duì)microRNA-106a促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲的其它可能機(jī)制，進(jìn)行深入研究。

綜上所述，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，高表達(dá)的microRNA-106a能夠通過下調(diào)TIMP-2通路，促進(jìn)細(xì)胞體外侵襲能力。microRNA-106a在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲中發(fā)揮著重要作用。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] 劉清華，于國華，劉雨清，等. CCR7和 VEGF-C 蛋白與乳腺癌預(yù)后之間的關(guān)系[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(8):1457-1460, 1465.

[2] Hainaut P, Plymoth A. Targeting the hallmarks of cancer: towards a rational approach to next-generation cancer therapy[J]. Curr Opin Oncol, 2013, 25(1):50-51.

[3] Sung MT, Hsu HT, Lee CC, et al. Krüppel-like factor 4 modulates the migration and invasion of hepatoma cells by suppressing TIMP-1 and TIMP-2[J]. Oncol Rep, 2015, 34(1):439-446.

[4] Su Y, Wan D, Song W. Dryofragin inhibits the migration and invasion of human osteosarcoma U2OS cells by suppressing MMP-2/9 and elevating TIMP-1/2 through PI3K/AKT and p38 MAPK signaling pathways[J]. Anticancer Drugs, 2016, 27(7):660-668.

[5] Di GK, George SJ, Jackson CL, et al. Differential effects of tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1 and TIMP-2 on atherosclerosis and monocyte/macrophage invasion[J]. Cardiovasc Res, 2016, 109(2):318-330.

[7] Shin SS, Park SS, Hwang B, et al. MicroRNA-106a suppresses proliferation, migration, and invasion of bladder cancer cells by modulating MAPK signaling, cell cycle regulators, and Ets-1-mediated MMP-2 expression[J]. Oncol Rep, 2016, 36(4):2421-2429.

[8] No?l A, Gilles C, Foidart JM. Invasion and metastatic dissemination in breast cancer: mechanisms[J]. Rev Med Liege, 2011, 66(5-6):274-278.

[9] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116(2):281-297.

[10] White MC, Pang L, Yang X. MicroRNA-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: towards a better model for cardiotoxicity?[J]. Food Chem Toxicol, 2016, 98(Pt A):17-24.

[11] Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(24):15524-15529.

[12] Zhang X, Ke X, Pu Q, et al. MicroRNA-410 acts as oncogene in NSCLC through downregulating SLC34A2 via activating Wnt/β-catenin pathway[J]. Oncotarget, 2016, 7(12):14569-14585.

[13] Stope MB, Hettenbach D, Kaul A, et al. The tumor suppressor microRNA-1 exhibits restricted inhibition of proli-feration of ovarian cancer cells[J]. Anticancer Res, 2016, 36(7):3329-3334.

[14] Xiao B, Guo J, Miao Y, et al. Detection of miR-106a in gastric carcinoma and its clinical significance[J]. Clin Chim Acta, 2009, 400(1-2):97-102.

[15] Chen L, Zhang F, Sheng XG, et al.MicroRNA-106a regulates phosphatase and tensin homologue expression and promotes the proliferation and invasion of ovarian cancer cells[J]. Oncol Rep, 2016, 36(4):2135-2141.

[16] Chernov AV, Sounni NE, Remacle AG, et al. Epigenetic control of the invasion-promoting MT1-MMP/MMP-2/TIMP-2 axis in cancer cells[J]. J Biol Chem, 2009, 284(19):12727-12734.

[17] Wang Z, Wang B, Shi Y, et al. Oncogenic miR-20a and miR-106a enhance the invasiveness of human glioma stem cells by directly targeting TIMP-2[J]. Oncogene, 2015, 34(11):1407-1419.

[18] Li P, Xu Q, Zhang D, et al. Upregulated miR-106a plays an oncogenic role in pancreatic cancer[J]. FEBS Lett, 2014, 588(5):705-712.

[19] Zhu M, Zhang N, He S, et al. MicroRNA-106a targets TIMP2 to regulate invasion and metastasis of gastric cancer[J]. FEBS Lett, 2014, 588(4):600-607.