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        MicroRNA-106a促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的機(jī)制研究*

        2018-07-02 00:43:38劉志平岳夢(mèng)琳
        中國病理生理雜志 2018年6期
        關(guān)鍵詞:乳腺癌

        劉志平,岳夢(mèng)琳

        (平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院, 河南 平頂山 467000)

        乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。侵襲是腫瘤的十大特征之一,也是導(dǎo)致乳腺癌患者不良預(yù)后甚至死亡的重要原因之一[2]。金屬蛋白酶組織抑制物2(tissue inhibitors of metalloproteinase 2,TIMP-2)通路在腫瘤的侵襲中具有極其重要的作用[3],TIMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP9)的抑制物,而MMP2和MMP9能夠降解幾乎所有類型的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),促進(jìn)腫瘤的侵襲[4]。大量研究已經(jīng)證實(shí),通過降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)MMP2和MMP9的表達(dá),可以抑制腫瘤細(xì)胞侵襲能力[5]。在多種腫瘤包括乳腺癌中,TIMP-2呈低表達(dá)[6],而具體機(jī)制尚不明確。微小RNA(microRNA,miRNA,miR)是一類長度約22~24 nt的非編碼小分子RNA,在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用,近年來的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-106a(microRNA-106a)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。因此,本研究將探討microRNA-106a是否通過調(diào)節(jié)TIMP-2通路,促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲,旨在為乳腺癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

        材 料 和 方 法

        1 材料

        人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購自Gibco;脂質(zhì)體Lipofectamine?3000、TRIzol試劑和RNA提取試劑盒均購自Invitrogen;microRNA序列和qPCR引物序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司;RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo;兔抗人TIMP-2多克隆抗體和兔抗人GAPDH單克隆抗體均購自Santa Cruz;兔抗人MMP2多克隆抗體和兔抗人MMP9多克隆抗體均購自CST;HRP標(biāo)記的羊抗兔 II 抗購自上海英基生物科技有限公司;ECL發(fā)光液購自Millipore;Matrigel購自上海前塵生物科技有限公司;雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

        二氧化碳培養(yǎng)箱(BB15,Thermo);超微量核酸蛋白測(cè)定儀(ND2000,Thermo);定量PCR擴(kuò)增儀(ABI 7500,ABI);凝膠成像儀(GelDoc-It,UVP);顯微鏡(BX61,Olympus)。

        2 方法

        2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10% 胎牛血清,1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素),37 ℃、5% CO2條件下中培養(yǎng),取復(fù)蘇后第4~10代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        取4×105個(gè)處于對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞,接種于6 cm培養(yǎng)皿中,24 h后采用脂質(zhì)體Lipofectamine?3000將microRNA-106a抑制物(microRNA-106a inhibitor)、microRNA-106a 模擬物(microRNA-106a mimic)及microRNA無關(guān)序列(即陰性對(duì)照組,negative control組)轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中,操作步驟參照試劑說明書。取未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對(duì)照組(control組)。

        2.2qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率 收集1×105細(xì)胞,各細(xì)胞樣品中加入1 mL TRIzol試劑,抽提細(xì)胞總RNA,按照RNA提取試劑盒的說明書操作。超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)總RNA濃度及純度,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。MMP2、MMP9、TIMP-2、GAPDH、microRNA-106a及內(nèi)參照U6的引物序列見表1。定量PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)microRNA-106a表達(dá)水平。qPCR擴(kuò)增體系為10 μL,反應(yīng)條件為: 50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示microRNA-106a相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        表1 qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for qPCR

        2.3Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 收集(2~5)×105個(gè)細(xì)胞,加入RIPA蛋白裂解液,抽提細(xì)胞全蛋白,BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白后,濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉1 h,TBS-T洗膜,加入兔抗人TIMP2多克隆抗體(1∶2 000稀釋)、兔抗人MMP2多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人MMP-9多克隆抗體(1∶1 000稀釋)和兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶2 000稀釋),4 ℃孵育過夜。TBS-T洗膜后,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔 II 抗(1∶10 000稀釋),室溫孵育1 h,加入ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影,凝膠成像儀對(duì)蛋白條帶進(jìn)行觀察,獲取圖像,并對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析(Image Lab軟件),記錄灰度值,計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參照蛋白的灰度比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 Transwell小室置于24孔板中,在小室的聚碳酸酯膜上加入4.0 g/L Matrigel 50 μL,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜,使Matrigel凝固;在24孔板下室中加入500 μL的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,Transwell小室中加入150 μL的細(xì)胞懸液(細(xì)胞總數(shù)約1×105個(gè));48 h后去除24孔板下室中的培養(yǎng)液,棉簽擦去Transwell小室內(nèi)室膜上的細(xì)胞,將Transwell小室置于0.1%結(jié)晶紫溶液中,室溫染色5 min,去離子水中洗滌后,顯微鏡下觀察,每孔隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照(×400),并記錄每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        2.5螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(luciferase reporter assay)檢測(cè)基因表達(dá)情況 PCR擴(kuò)增克隆人TIMP-2基因3’非翻譯區(qū)(3’ untranslated region,3’-UTR),經(jīng)限制性內(nèi)切酶SmaI和KpnI酶切后,插入pGL3-Basic螢光素酶報(bào)告基因載體,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定,構(gòu)建含有TIMP-2基因3’-UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT,同時(shí)構(gòu)建含有突變TIMP-2基因3’-UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut。

        MDA-MB-231細(xì)胞接種于24孔板中,融合度在70%~80%時(shí),脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染microRNA-106a inhibitor(或microRNA-106a mimic),報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT(或pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut或pGL3-Basic空載體)以及pRL-SV40海腎螢光素酶表達(dá)載體內(nèi)參照質(zhì)粒;每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染48 h后,采用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),操作步驟如下:棄去培養(yǎng)液,預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次,每孔加入100 μL PLB裂解液,-80 ℃冰箱裂解1 h,收集細(xì)胞裂解液,離心,取上清。EP管中加入10 μL上清,再加入50 μL LAR II,檢測(cè)螢火蟲螢光素酶活性;隨后加入50 μL Stop & Glo試劑,檢測(cè)內(nèi)參照海腎螢光素酶的活性,兩者的比值即為pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT、pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut和pGL3-Basic空載體的相對(duì)螢光素酶活性。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩處理效應(yīng)組間比較采用t檢驗(yàn),多處理效應(yīng)組間比較采用單因素方差分析,并用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 MicroRNA-106a inhibitor及microRNA-106a mimic的轉(zhuǎn)染效率

        轉(zhuǎn)染microRNA-106a inhibitor 48 h后,細(xì)胞內(nèi)的microRNA-106a表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05);而轉(zhuǎn)染microRNA-106a mimic 48 h后,細(xì)胞內(nèi)的microRNA-106a表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05),見圖1。

        Figure 1. The expression levels of microRNA-106a in breast cancer MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

        圖1乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)microRNA-106a表達(dá)水平

        2 MicroRNA-106a對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用

        為研究microRNA-106a對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲影響,在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了microRNA-106a inhibitor/mimic,隨后采用Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的變化情況。經(jīng)單因素方差分析顯示,4組整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.286,P=0.001)。MicroRNA-106a inhibitor組的侵襲細(xì)胞數(shù)目低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),microRNA-106a mimic組的侵襲細(xì)胞數(shù)目高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖2。

        Figure 2. The effect of microRNA-106a on the invasion ability of breast cancer MDA-MB-231cells (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05 control group.

        圖2MicroRNA-106a對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231侵襲能力的影響

        3 MicroRNA-106a對(duì)TIMP-2通路的影響

        qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,3組中TIMP-2、MMP2及MMP9的mRNA相對(duì)表達(dá)量整體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染microRNA-106a mimic 48 h后,細(xì)胞內(nèi)MMP2和MMP9的mRNA相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05),陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;細(xì)胞內(nèi)TIMP-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05),陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖3A。

        Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3B。單因素方差分析顯示,3組TIMP-2、MMP2及MMP9 的蛋白相對(duì)表達(dá)量整體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染microRNA-106a mimic 48 h后,細(xì)胞內(nèi)MMP2和MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05),陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;細(xì)胞內(nèi)TIMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05),陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

        4 螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)microRNA-106a對(duì) TIMP-2通路的調(diào)控作用

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)單因素方差分析顯示,整體差異顯著(F=265.931,P=0.000)。MicroRNA-106a inhibitor+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT組的相對(duì)螢光素酶活性高于microRNA-106a inhibitor+pGL3-Basic空載體對(duì)照組和microRNA-106a inhibitor+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut組(P<0.05);microRNA-106a mimic+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT組的相對(duì)螢光素酶活性低于microRNA-106a mimic+pGL3-Basic空載體對(duì)照組和microRNA-106a mimic+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut組(P<0.05)。

        討 論

        乳腺癌是女性健康的第一殺手,隨著不斷更新的綜合治療方案的出現(xiàn),乳腺癌患者的治療效率得到了很大的提高,然而,侵襲與復(fù)發(fā)是導(dǎo)致乳腺癌患者不良預(yù)后甚至死亡的重要原因之一。探尋導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生侵襲的內(nèi)在機(jī)制,尋找能夠預(yù)測(cè)甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤侵襲的靶標(biāo),是臨床上亟待解決的問題[8]。

        近年來,microRNA調(diào)控基因表達(dá)的功能受到廣泛的關(guān)注,有研究表明,microRNA能夠調(diào)控大約60%的蛋白編碼基因[9]。microRNA是由Drosha酶和Dicer酶剪切microRNA前體而來,它能夠通過與靶基因mRNA的3’-UTR區(qū)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平或者轉(zhuǎn)錄后水平,降低靶基因的表達(dá)水平,導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。Calin等[11]在2002年首次提出了microRNA與腫瘤相關(guān),證實(shí)microRNA-15a和microRNA-16-1缺失能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。目前,愈來愈多的研究證實(shí),microRNA在腫瘤中發(fā)揮著類似抑癌基因或癌基因的作用[12-13]。在各種腫瘤組織中,microRNA-106a的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞包括乳腺癌細(xì)胞的凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān),Xiao等[14]在胃癌中的研究表明,microRNA-106a的高表達(dá)與腫瘤的分期、分化、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān);Chen等[15]研究證實(shí),microRNA-106a能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲;而Shin等[7]的研究則表明,在膀胱癌細(xì)胞中,microRNA-106a能夠通過調(diào)節(jié)MAPK通路,抑制細(xì)胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移。本研究則分析microRNA-106a在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲過程中的作用,并對(duì)其內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行初步探討。

        Figure 3. The effects of microRNA-106a on the expression of TIMP-2, MMP2 and MMP9 at mRNA (A) and protein (B) levels in breast cancer MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsnegative control group.

        圖3MicroRNA-106a對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中TIMP-2、MMP2以及MMP9的mRNA和蛋白表達(dá)的影響

        Figure 4. The regulatory role of microRNA-106a in the TIMP-2 pathway investigated by luciferase reporter assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspGL3-Basic empty vector group;#P<0.05vspGL3-Basic-TIMP-2-3’UTR WT group.

        圖4螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)microRNA-106a對(duì)TIMP-2通路的調(diào)控作用

        我們首先在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染了microRNA-106a inhibitor 和microRNA-106a mimic,48 h后細(xì)胞內(nèi)的microRNA-106a水平分別顯著地降低和升高。采用Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)探究microRNA-106a與乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力之間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)microRNA-106a能夠顯著增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。ECM是腫瘤侵襲過程中必須突破的障礙,MMP2和MMP9能夠降解ECM,促進(jìn)腫瘤的侵襲,而TIMP-2是MMP2和MMP9的天然抑制劑,TIMP-2增加,將抑制腫瘤的侵襲[16]。在探討microRNA-106a促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的機(jī)制研究中,本研究重點(diǎn)關(guān)注了TIMP-2信號(hào)通路。上調(diào)microRNA-106a表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn),MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)的TIMP-2的 mRNA與蛋白表達(dá)水平顯著降低,而其抑制底物MMP2和MMP9的mRNA與蛋白表達(dá)水平顯著增加。采用螢光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)來研究microRNA-106a是否能夠直接調(diào)控TIMP-2的表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在microRNA-106a inhibitor 和microRNA-106a mimic對(duì)報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT的活性有顯著影響,即microRNA-106a inhibitor能夠增強(qiáng)pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT的活性,而microRNA-106a mi-mic則降低了pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT的活性,證實(shí)microRNA-106a能夠直接調(diào)控TIMP-2的表達(dá)。本研究證實(shí),在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中,microRNA-106a表達(dá)增加后,細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng),并且高表達(dá)的microRNA-106a能夠降低MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)TIMP-2的表達(dá),增加MMP2和MMP9的表達(dá);螢光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)證實(shí),microRNA-106a 能夠直接負(fù)調(diào)控TIMP-2的表達(dá)。已有研究證實(shí),microRNA-106a通過調(diào)控TIMP-2基因表達(dá),促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞[17]、胰腺癌[18]和胃癌[19]等腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移。本研究并未對(duì)其它與細(xì)胞侵襲相關(guān)的信號(hào)通路和基因進(jìn)行探討,在后期研究中,將對(duì)microRNA-106a促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲的其它可能機(jī)制,進(jìn)行深入研究。

        綜上所述,乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中,高表達(dá)的microRNA-106a能夠通過下調(diào)TIMP-2通路,促進(jìn)細(xì)胞體外侵襲能力。microRNA-106a在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲中發(fā)揮著重要作用。

        [參 考 文 獻(xiàn)]

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